《菌種改造技術(shù)》word版

1、 菌種改造技術(shù) 摘要：微生物在工業(yè)上的應(yīng)用日益增多，而一般從自然中得到的微生物產(chǎn)率都不高，達(dá)不到生產(chǎn)要求，而經(jīng)過改造后的菌種產(chǎn)率會(huì)大幅度提高。本文論述了誘變育種、代謝調(diào)控育種、基因重組育種等菌種改造技術(shù)。關(guān)鍵字：菌種改造；技術(shù)微生物已廣泛的應(yīng)用到醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、釀酒等各個(gè)領(lǐng)域，都取得了很好的效益，而原始的微生物產(chǎn)率都不高，我們必須對(duì)其進(jìn)行菌種改造，才能更好的應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域中。微生物改造的技術(shù)有很多，例如，選擇性培養(yǎng)、誘變育種、代謝調(diào)控育種和基因重組等1。這些技術(shù)的應(yīng)用，促使微生物產(chǎn)率大幅度提高，微生物產(chǎn)品應(yīng)用越來越廣。微生物菌種改造技術(shù)涉及微生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等多門學(xué)科，是

2、一個(gè)綜合性的應(yīng)用技術(shù)。1.出發(fā)菌株的選擇發(fā)酵工業(yè)上選用的菌株最初都是從自然界中分離出來的，篩選出優(yōu)良的菌株是菌種改造的第一步，也是很重要的一步。菌株的自然選育包括采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離、性能測(cè)定等2步驟。 （1）采樣 采樣地點(diǎn)的確定要根據(jù)篩選的目的、微生物的分布狀況以及菌種的主要特征與外界環(huán)境等，進(jìn)行綜合、具體的分析來決定。如果預(yù)先不知道微生物的具體來源，一般可從土壤中分離。采樣的方法多是在選好的地點(diǎn)，取離地面515 cm的土壤幾十克，盛入預(yù)先消毒好的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，記錄采樣的時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境狀況，以備參考。（2）增殖培養(yǎng) 收集到的樣品，如果目標(biāo)菌株比較多，可直接進(jìn)行分離并進(jìn)行增殖

3、培養(yǎng)。而如果目標(biāo)菌株比較少，則需要對(duì)其進(jìn)行富集培養(yǎng)。提供有利于所需菌株生長(zhǎng)而不利于其它菌型生長(zhǎng)的條件，使所需菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。例如，生產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí)，使用植物油作為唯一碳源，可以更快而準(zhǔn)確地分離出產(chǎn)生脂肪酶的菌株。（3）純種分離 通過增殖培養(yǎng)還不能得到微生物的純種，因?yàn)樯a(chǎn)菌在自然情況下通常與各種菌混雜在一起，所以有必要進(jìn)行分離純化，才能獲得純種。分離純化的方法常選用菌落分離法。把菌種制備成單孢子或單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尯笤僭谄桨迳线M(jìn)行劃線分離。菌種經(jīng)過多次從點(diǎn)到線的稀釋，最后經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落。（4）生產(chǎn)性能的測(cè)定 純種分離后需要對(duì)菌株的生產(chǎn)性能做測(cè)定，一般使用兩步法，

4、即初篩和復(fù)篩。而作為育種的出發(fā)菌株，這種直接從自然界分離得到的菌株成為野生菌株以區(qū)別于人工育種得到的變異菌株。經(jīng)過以上四步培養(yǎng)出的菌株即為出發(fā)菌株，出發(fā)菌株的優(yōu)劣對(duì)于菌種改造有著重要的影響，所以在增殖培養(yǎng)和純種分離是培養(yǎng)基的選擇很重要。我們需要在實(shí)驗(yàn)前對(duì)目標(biāo)菌種有充分的了解，根據(jù)其特性配制培養(yǎng)基使之更好的和其他菌株分離。2.誘變育種 （工業(yè)菌種基因超級(jí)誘變技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用研究）二戰(zhàn)期間，由于青霉素高產(chǎn)菌株的急需，人們進(jìn)行了最早的通過誘變技術(shù)篩選性能改進(jìn)菌種的工作。突變泛指微生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，突變往往導(dǎo)致產(chǎn)生新的等位基因及新的表現(xiàn)型。然而自然條件下基因突變的概

5、率非常低，所以我們采取人工誘變的方式使微生物發(fā)生可遺傳的變異，然后通過選擇作用保留下對(duì)我們有益的菌株，完成誘變育種。2.1誘變劑的類型（1）物理因素 物理因素有很多包括紫外線、X射線、射線、射線、射線以及快中子和超聲波等。由于紫外線應(yīng)用最為廣泛,效果好，操作方便，我們?cè)诖藢?duì)紫外線誘變做以詳細(xì)介紹。一般誘變用15W低功率的紫外燈，這時(shí)燈光集中于2537A1，是較有效的誘變作用光譜。具體操作方法：在暗室中安裝具有穩(wěn)壓裝置的15W紫外線燈管，將5mL菌懸液注入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，放置在離燈管30cm左右的位置，培養(yǎng)皿底要放平，處理前贏先開燈20-30min，預(yù)熱穩(wěn)定。照射時(shí)啟動(dòng)電磁攪拌裝置，以保證

6、照射均勻。一般微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在上述條件下幾十秒鐘即可死亡，因此要選用適當(dāng)劑量照射。還應(yīng)當(dāng)注意的是，為了避免光復(fù)活作用，誘變后應(yīng)再紅光下操作，處理后的菌懸液若需進(jìn)行增殖培養(yǎng)，也要用黑布包起來。（2）化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑用量少、設(shè)備簡(jiǎn)單，所以今年來發(fā)展較快。但是一般的化學(xué)誘變劑都有毒且多為致癌物，所以在使用時(shí)應(yīng)當(dāng)格外小心謹(jǐn)慎。同一誘變劑對(duì)不同微生物或同一微生物不同條件下處理作用效果也不同，因此在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)認(rèn)真考慮。我們根據(jù)化學(xué)因素的作用方式，可以把它分為堿基類似物、引起DNA和核苷酸組成成分變化的化合物和改變DNA結(jié)構(gòu)的化合物三種。堿基類似物的作用原理是堿基類似物能夠代替DNA結(jié)構(gòu)中的四種堿基進(jìn)

7、入到DNA中去，而又不妨礙DNA的復(fù)制，由于他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變了，就有可能引起變異。常用于誘變的堿基類似物有：5-溴尿嘧啶、5-溴脫氧尿核苷、2-氨基嘌呤等。引起DNA和核苷酸組成成分變化的化合物主要是指烷化劑和亞硝酸類物質(zhì)。烷化劑類的誘變劑帶有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，此烷基能轉(zhuǎn)移到其他分子中電子密度高的位置上去，所有這些物質(zhì)通過烷化磷酸基、嘌呤和嘧啶與DNA作用。改變DNA結(jié)構(gòu)的化合物能同DNA或RNA作用改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，但又不形成共價(jià)鍵，引起突變。（3）其他因素誘變因素除物理因素化學(xué)因素外，還有抗生素、殺菌劑、脫氧核糖核酸和增變因子等，其中以抗生素應(yīng)用最廣。2.2誘變育種的步驟和方法誘變育種的

8、一般方法3，如圖所示：從圖中可以看出，誘變育種的一般過程與上述出發(fā)菌株的選擇步驟基本一致，只是加入了誘變處理的操作。由于各種誘變劑都有其作用的特殊性，但是目前對(duì)絕大多數(shù)微生物表現(xiàn)各種性狀的相應(yīng)基因了解還很不夠，所以要求通過選用誘變劑來達(dá)到某一性狀的改變，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)做不到。誘變劑的選擇只能靠實(shí)際的工作經(jīng)驗(yàn)。誘變處理的方法有單一誘變劑處理、紫外線和光照復(fù)活交替處理和復(fù)合處理。紫外線照射和光照復(fù)活交替的處理方法能夠大大提高突變的概率；兩種誘變劑復(fù)合處理的作用效果也要明顯優(yōu)于單一誘變劑處理。3.代謝調(diào)控育種代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)對(duì)生命過程是絕對(duì)必需的，這種機(jī)制是的微生物對(duì)培養(yǎng)條件具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。典型的細(xì)菌細(xì)胞整

9、個(gè)遺傳過程要形成1000多種酶。細(xì)胞的協(xié)調(diào)功能確保在任何特定的時(shí)刻只形成特定的酶。協(xié)調(diào)功能控制酶的合成量，一旦酶合成，其活性又受到激活因子和抑制因子的調(diào)節(jié)。因此盡管遺傳基因不變，微生物根據(jù)環(huán)境變化有改變自身組成和代謝的驚人能力。環(huán)境雖不能改變其基因型但卻影響著他的表現(xiàn)型。其調(diào)節(jié)機(jī)制主要是控制微生物產(chǎn)物的生產(chǎn)彈性和防止產(chǎn)生過量的中間產(chǎn)物。代謝的調(diào)控類型主要有誘導(dǎo)、碳分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)、氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)、磷硫的調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)。3.1代謝的產(chǎn)物調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)主要包括初級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。初級(jí)代謝產(chǎn)生細(xì)胞中的小分子，這些小分子是合成生物大分子的材料或輔酶。為了控制支路的反饋調(diào)節(jié)就

10、要采取兩種操作：降低抑制型或阻遏型終產(chǎn)物的濃度。初級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)的方式主要有：（1）降低產(chǎn)物的濃度 在一些較為簡(jiǎn)單的代謝途徑中用這種辦法能積累中間產(chǎn)物。在一條從A到E的代謝途徑中，如果要積累化合物C，首先要獲得缺失酶C的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株，這樣的突變株需要E存在才能生長(zhǎng)，添加低濃度的E使得生物體不能積累到有抑制或遏制水平的E。這樣C就會(huì)積累。（2）反饋抗性突變 用所需化合物的毒性類似物容易分離出某個(gè)酶反饋一直抗性或酶合成系統(tǒng)反饋?zhàn)瓒敉蛔冎?。講培養(yǎng)物涂布到含有這種抗代謝物的平皿上能殺死大多數(shù)細(xì)胞從而篩到抗性突變株，其中有些可能過量代謝。次級(jí)代謝產(chǎn)物是由很少的一些微生物產(chǎn)生的，盡管他們對(duì)于某些特殊

11、的微生物很重要，但在生命過程中沒有普遍性的功能，他們通常是相關(guān)化合物的混合物。次級(jí)代謝調(diào)節(jié)的方式主要有：（1）酶的去阻遏 次級(jí)代謝物產(chǎn)生的一個(gè)特點(diǎn)為次級(jí)代謝物在分批培養(yǎng)的菌體快速生長(zhǎng)階段通常不產(chǎn)生而在后期形成。在恒化器的稀釋率無限降低的過程中，酶的專一活力到達(dá)一個(gè)峰值后開始降低。限量添加不同的營(yíng)養(yǎng)物酶活在不同的生長(zhǎng)速率下達(dá)到峰值。（2）反饋調(diào)節(jié) 次級(jí)代謝物的積累能反饋調(diào)節(jié)他們自身合成過程，初級(jí)代謝終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)初始代謝共同的酶。（3）碳源分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié) 在碳源代謝代謝阻遏機(jī)理被普遍認(rèn)識(shí)之前，抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)了碳源分解代謝阻遏。在青霉素生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)早期就發(fā)現(xiàn)能被快速利用的葡萄糖是生產(chǎn)青霉素的

12、最差碳源，乳糖雖然僅能唄緩慢用于生長(zhǎng)，卻有利于青霉素的形成。經(jīng)典的化學(xué)培養(yǎng)基含有葡萄糖和乳糖，在這樣的培養(yǎng)基中產(chǎn)黃青酶在生長(zhǎng)期時(shí)快速利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡后，乳糖利用的阻遏去除了，生長(zhǎng)期開始緩慢利用乳糖，抗生素便能夠大量合成。此外還有調(diào)節(jié)氮源，調(diào)節(jié)磷以及對(duì)微生物進(jìn)行誘導(dǎo)等方法。3.2營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指喪失了合成某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，在培養(yǎng)基中若不外加這種營(yíng)養(yǎng)成分就不能正常生長(zhǎng)。篩選出營(yíng)養(yǎng)缺陷型的方法，一般是經(jīng)誘變后經(jīng)過中間培養(yǎng)淘汰野生型，檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型和確定生長(zhǎng)譜等。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要靈活運(yùn)用。（1）中間培養(yǎng) 由于發(fā)生突變后，變異的細(xì)胞需要培養(yǎng)一代至幾代才能夠完全分離，為了減

13、少以后篩選中再產(chǎn)生這種分離的混種現(xiàn)象，所以在缺陷型首次分離前，先進(jìn)行中間培養(yǎng)是必要的。中間培養(yǎng)基可以是完全培養(yǎng)基或者補(bǔ)充培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜即可。 （2）淘汰野生型 淘汰野生型祈禱濃縮缺陷型的作用，主要方法有抗生素法和過濾法?？股刂饕怯们嗝顾?，將中間培養(yǎng)后的菌種在基本培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，野生型可大量生長(zhǎng)，而突變型由于營(yíng)養(yǎng)缺陷生長(zhǎng)受到抑制，這時(shí)用青霉素處理，殺死正在分裂繁殖的野生型，而保留了突變型。用離心法可將未被破壞的細(xì)胞分離出來。過濾濃縮法應(yīng)用于霉菌和鏈球菌。在基本培養(yǎng)基上涂布孢子，野生型可以快速生長(zhǎng)，而缺陷型不能生長(zhǎng)，用過濾法可將未生長(zhǎng)的缺陷型孢子分離出來。（3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 檢出方法很

14、多，包括逐個(gè)測(cè)定法、夾層檢出法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)基檢出法、影印培養(yǎng)法等。（4）確定生長(zhǎng)譜 經(jīng)過檢出后，需要測(cè)定是什么缺陷型。將生長(zhǎng)斜面用無菌水洗下或培養(yǎng)液離心，沉淀物用生理鹽水洗滌后制成細(xì)胞懸浮液。去0.1mL涂布在MM上，也可以與已融化并冷卻到50的MM混勻，倒入平皿中。然后在含菌體平皿上放置少量試驗(yàn)物質(zhì)，觀察生長(zhǎng)情況，確定缺陷型的類別。4.基因重組育種基因重組廣義而言是指基因型不同的個(gè)體交配產(chǎn)生不同于親本基因型的個(gè)體，這表明進(jìn)行了遺傳信息的重組。微生物的基因重組可以這樣來分類：通過雙親細(xì)胞的融合，涉及整套染色體基因的重組；通過雙親細(xì)胞的溝通。涉及部分染色體基因的重組；雙親細(xì)胞不接觸，但涉及個(gè)別

15、或少數(shù)基因的重組，如轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。4.1雜交育種的方法以酵母菌的雜交為例，步驟包括酵母子囊孢子的形成，子囊孢子的分離和酵母雜種的獲得。（1）子囊孢子的形成 產(chǎn)包子酵母在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)會(huì)引起省包子能力衰退，要形成子囊孢子就需要用生孢子培養(yǎng)基。應(yīng)為往往在饑餓條件下才會(huì)減數(shù)分離形成孢子，所以生孢子培養(yǎng)基通常營(yíng)養(yǎng)是比較缺乏的。（2）子囊孢子的獲得 用幾毫升蒸餾水洗下斜面或平皿上的子囊，加入1mL液體石蠟和5g硅藻土，在勻漿皿中研磨10分鐘，然后在離心機(jī)中4500r/min離心10分鐘，子囊孢子集中在最上一層石蠟中。（3）取集中子囊孢子的液蠟0.05mL，加入0.05mL15%的明膠，涂CM板，就

16、可獲得單倍體菌落。如果要進(jìn)行雜交可用顯微操作器將子囊孢子配對(duì)，進(jìn)行微滴培養(yǎng)，使之發(fā)芽結(jié)合形成合子。4.2轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)也是通過遺傳物質(zhì)間的重組而達(dá)到育種目的的方法，但他們不是通過兩親株直接接觸，而是通過其他手段達(dá)到重組目的的一些方法。轉(zhuǎn)化育種是把對(duì)遺傳起決定作用的DNA從甲菌中拿出來又放到乙菌中去，甲菌的部分遺傳性狀轉(zhuǎn)移到乙菌中。其步驟包括DNA的提取，轉(zhuǎn)化操作及轉(zhuǎn)化體的檢出。轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌體做媒介，將一個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)傳遞給另一個(gè)細(xì)胞的過程。與轉(zhuǎn)化一樣，無需細(xì)菌細(xì)胞直接接觸。轉(zhuǎn)化中突出的問題是供體DNA易為受體DNA酶所破壞，難以進(jìn)入，但轉(zhuǎn)導(dǎo)是借助噬菌體將DNA帶入感染記住，使之改變特性。

17、所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵是選擇合適的噬菌體。4.3原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體技術(shù)育種是在經(jīng)典基因重組基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的更為有效的方法。原生質(zhì)體融合育種雜交率高、瘦結(jié)合型或致育型的限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整等優(yōu)點(diǎn)。原生質(zhì)體融合的步驟：（1）標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證；（2）原生質(zhì)體制備；（3）等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合；（4）涂布與再生培養(yǎng)基，再生出菌落；（5）選擇性培養(yǎng)基上劃線生長(zhǎng)，分離驗(yàn)證，跳去融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏；（6）生產(chǎn)性能篩選。5.基因工程育種基因工程又稱重組DNA技術(shù)，是指講一種或多種生物的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物，是受體按人們的愿望表現(xiàn)出新的性狀。基因工程最典型的操作一般包括三個(gè)步驟：外源DNA的獲得與酶切、外源DNA與經(jīng)同樣酶切的載體的連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞級(jí)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選。主要材料有外源DNA、載體、DNA體外重組用的酶及宿主細(xì)胞。江南大學(xué)王正祥等人利用DNA重組技術(shù)或得了一種高發(fā)酵產(chǎn)率的酒精酵母4。其主要思想是將酸性蛋白酶基因通過酵母的整合型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到工業(yè)酒精酵母中，酸性蛋白酶的表達(dá)可以水解原料中的蛋白質(zhì)，增加醪液中酵母可吸收性氮，促進(jìn)酵母的增殖。應(yīng)用這種重組酵母可提高酒精發(fā)酵速率，發(fā)酵周期縮短38%，而且并減少底物流失和能耗，提高原料出酒率，相對(duì)出酒率提高