制備色譜分離技術及實際應用

1、制備色譜分離技術及實際應用Contents 凝膠色譜分離技術及其應用1 高速逆流色譜分離技術2 制備薄層色譜分離技術3 制備柱色譜分離技術4概述 親和色譜分離技術5色譜（Chromatography)“色譜”這一術語是根據“Chromatography”一詞翻譯而來的 。它是由俄國植物學家茨維特（Tsweet）于1903年首創(chuàng)的，是由一個實驗而得名。后來擴展到紙色譜、薄層色譜、電泳、逆流色譜等不同形式的色譜。色譜（Chromatography)色譜法是一種物理化學分析方法。根據所用樣品混合物中各組分物理、化學性質的差異，各組分在互不混溶的兩相之間分配、吸附、分子親和力等行為存在差異，當兩相相對

2、運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。色譜法是一種從混合物中分離組分的方法。色譜法能分離物理化學性質差異很小的用其他方法很難分離的化合物。填充劑由碳酸鈣發(fā)展到硅膠、離子交換樹脂、凝膠等，流動相也出現了氣相、超臨界流體流動相。分離的規(guī)模也從實驗室毫克到了以噸計的工業(yè)規(guī)模。色譜技術在中藥中的應用已經日趨重要，其中尤以大孔吸附樹脂、離子交換色譜、硅膠色譜等的應用最為廣泛。在人參皂苷、絞股藍皂苷、甜菊苷等多種中藥的單方、復方、有效部位、有效成分等的生產中得到廣泛應用，成為分離純化的重要手段。第一節(jié) 概述一、制備色譜簡介 利用各待分離組分在相間的吸附、分配系數的差異、離子交換平衡

3、值的區(qū)別等，使得各組分在相間滯留時間不同而進行分離，從而制得所需產品。大型制備色譜-噸計； 微型制備色譜-克、毫克二、色譜分離原理及特點利用各組分在互不混溶的兩相之間分配、吸附、分子親和力等行為的差異，并通過兩相不斷的相對移動而實現分離的方法的總稱。互不混溶的兩相分別是固定相（stationary phase，表面積很大或多孔性固體）和流動相（mobile phase，展開劑-液相或氣相）。下圖是分離機理過程的模型。圖 6-2 與其他分離技術如萃取、蒸餾等相比，色譜法具有高超分離能力和效率，其特點主要如下：1. 分離效率高分析出較復雜的樣品。 2靈敏度高可以檢測出10-13g級的物質。3分析速

4、度快幾分鐘幾十分鐘。4應用范圍廣有機、無機、低分子或高分子等。色譜法的特點三、色譜的分類按流動相類型 氣相色譜，液相色譜，超臨界流體 按固定相的形狀柱色譜，紙色譜，薄層色譜 按分離機制吸附色譜（固定相為固體），分配色譜（固定相為液體），凝膠滲透，離子交換色譜、親和色譜、大孔吸附樹脂法、聚焦色譜 按操作壓力 低壓（0.5MPa），中壓（0.5-4.0MPa），高壓（4.0-40MPa）液相色譜 按展開方式洗脫，前沿，置換按使用領域分析用色譜、制備用色譜、流程色譜 （2）液相色譜：液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC） 液固(LSC)、液液色譜(LLC)柱色譜、紙色譜、薄層色譜、排阻色譜、超臨界色譜

5、及電色譜等形式。1、按流動相和固定相的狀態(tài)分類（1）氣相色譜：氣體為流動相的色譜。根據固定相是固體吸附劑還是固定液，氣固色譜（GSC）氣液色譜（GLC）流動相和固定相的狀態(tài)分類（3）超臨界流體色譜2、按分離機理分類（1）吸附色譜法是利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法。組分與吸附劑之間的作用力主要為分子間力，與兩者的極性有關 。（2）分配色譜法利用各個被分離組分在固定相和移動相兩相之間分配系數的不同 而進行分離的過程。分配色譜主要根據物質在兩相中的溶解度差異而實現。 固定相為涂漬有固定液（液體）的多孔惰性載體。 硅膠、硅藻土、聚合物、纖維素粉、濾紙 若采用極性較大的相

6、為固定相、極性較小的相為流動相，則稱為正相色譜；相反，則稱為反相色譜。實踐中有70以上都采用反相色譜。色譜類型固定相極性度流動相極性范圍沖洗劑極性或非極性的程度增加流動相極性的效果正相色譜極性弱至中等極性最后沖洗用極性更強的溶劑保留時間減少反相色譜非極性強至中等極性首先沖洗用極性更強的溶劑保留時間增加表6-2 正相和反相色譜中流動相極性的關系 2、按分離機理分類 是利用大小不同的分子在微孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法。 又稱尺寸排阻色譜法、空間排阻或分子篩色譜是利用組分與離子交換劑（固定相）結合力強弱的差異而達到分離的方法。被分離混合物中各組分的離子交換能力，將取決于各組分電荷的差異。

7、利用固相載體上的配基對目標組分所具有的專一的和可逆的親和力而使生物分子分離純化的方法，又稱親和層析和吸附解吸色譜 。專一而又可逆的親和力的生物分子 稱為生物對。酶一酶底物、抑制劑、輔酶或輔基；抗體一抗原、細胞一細胞表面特異蛋白、外源凝集素等。 （3）離子交換色譜法（4）凝膠色譜法 （5）親和色譜法 （6）聚焦色譜法 利用具有兩性電解質特點的組分如氨基酸和蛋白質、酶等在等電點上的差異，當混合物流經具有pH梯度的固定相時，各組分在相應的等電點上進行聚焦而達到分離的目的 。 疏水作用色譜利用蛋白質表面在非變性狀態(tài)下容易與非極性物質相互作用的性質，從而將溶解性不同的蛋白質得以分離。上述方法主要用于兩性

8、電解質或蛋白質的分離純化。 2、按分離機理分類3. 按固定相的外形分類 柱色譜：固定相裝于柱內的色譜法?？煞譃樘畛渲V法和開管柱色譜法。平板色譜：固定相呈平板狀的色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。 4. 按色譜動力學分類 洗脫法：又稱淋洗法，如將3組分的樣品注入色譜法，流動相連續(xù)流過色譜，并攜帶樣品組分在柱內向前移動，經色譜分離后，樣品中不同組分依據與固定相和流動相相互作用的差別，而順序流出色譜柱。前沿法：又稱迎頭法，如將含3個等量組分的樣品溶于流動相中，組成混合物溶液，并連續(xù)注入色譜柱。此法僅第一個組分純度較高。置換法：又稱頂替法，待分離混合物樣品與固定相有強作用力，因此需使用一種比樣品組

9、分與固定相間作用力更強的置換劑做流動相，當它注入色譜柱后，可迫使滯留在柱上的各個組分依次洗脫下來。5. 按使用領域不同對色譜儀的分類 分析用色譜儀：這類色譜儀主要用于各種樣品的分析，其特點是色譜柱較細，分析的樣品量少。 制備用色譜儀：制備用色譜儀又可分為實驗室用制備型色譜儀和工業(yè)用大型制造純物質的制備色譜儀。 流程色譜儀：流程色譜儀在工業(yè)生產流程中為在線連續(xù)使用的色譜儀。四、色譜法中常用的術語與參數色譜圖 ：各組分經色譜柱分離后，從柱后流出進入檢測器，檢測器將各組分濃度（或質量）的變化轉換為電壓（或電流）信號，再由記錄儀記錄下來。所得的電信號強度隨時間變化的曲線，稱為流出曲線，也叫色譜圖。1.

10、 區(qū)域寬度 (1) 標準偏差：W1的一半叫標準差，即峰高處色譜峰寬的一半。 半峰寬W1/2：即峰高一半處對應的峰寬。 它與標準偏差的關系為 W1/2。峰底寬度Wb ：即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上截距間的距離。 它與標準偏差的關系為 Wb =4。W1Wb2. 保留值 保留值是各組分自色譜柱中滯留的數值，通常包括時間、距離及各組分流出色譜柱所需要的流動相的體積等參數。 （1）保留時間 保留時間（retention time, tR）：從進樣到柱后某個組分出現濃度極大值的時間。死時間（dead time, t0）：不保留組分的保留時間，即流動相通過色譜柱的時間。調整保留時間（adjusted r

11、etention time, tR）：扣除死時間后的保留時間。 （2）保留體積保留體積（retention volume, VR）：從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱為洗脫體積。 VR=tRFc死體積（dead volume, V0）：由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小 。V0=t0Fc調整保留體積（adjusted retention volum

12、e, VR）：扣除死體積后的保留體積。 VR=VR-V0= tR Fc3. 分配系數 樣品在固定相和流動相中的分離達平衡時， Cs（固定相濃度）和Cm（流動相的濃度）的比值為平衡系數 K=Cs/Cm 在各種色譜中K的表示方法有區(qū)別。分配色譜：K為分配系數表示為：對吸附色譜而言 K為吸附系數，表示為 ：4. 容量因子 在兩相分配達平衡時，物質在兩相的量的比為容量因子（或分配容量、容量比、質量分配系數）。物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，tR0；K越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長

13、。 5. 選擇性因子 選擇性因子（selectivity factor）為相鄰兩組分分配系數或容量因子之比。它可以表示為：要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上說， 的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。五、色譜法的基本理論（一）塔板理論塔板理論認為溶質在色譜柱內的一次分配平衡，需要在一定的柱高內完成，通常將這段色譜柱稱為一個理論板（theoretical plate），其高度稱為理論塔板當量高度H（height equivalent to a theoretical plat

14、e，HETP）或塔板高度。色譜柱中存在著許多塔板。塔板理論的基本假設為：（1）樣品的各組分都加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。（2）流動相是間歇式進入色譜柱，每次進入一個塔板體積。（3）在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。設高度為L的色譜柱的理論板數為N，則：單位長度的柱內塔板數越多則柱效越高。保留時間峰底寬（二）速率理論 速率方程（也稱范.弟姆特方程式）: H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s) 減小A、B、C三項可提高柱效； 存在著最佳流速； A、B、C三項各與哪些因素有關？1. 渦流擴散項A A = 2dp dp：固定相的

15、平均顆粒直徑：固定相的填充不均勻因子 固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象減輕，色譜峰較窄。2. 分子擴散項B B = 2 Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，1。 Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數（cm2s-1）。由于柱中存在著濃度差，產生縱向擴散： a. 擴散導致色譜峰變寬，H(n)，分離變差。 b. 分子擴散項與流速有關，流速，滯留時間，擴散， c. 擴散系數：Dg （M載氣）-1/2 ； M載氣，B值3.傳質阻力項 C 組分在氣相和液相兩相間進行反復分配時，遇到阻力。傳質阻力包括氣相傳質阻力Cg和液相傳質阻力CL ，液相傳質阻力大于氣相傳

16、質阻力。即： C =（Cg + CL）4. 載氣流速與柱效-最佳流速 載氣流速高時： 傳質阻力項是影響柱效的主要因素，隨著流速的提高，柱效下降,右圖曲線的右邊。 載氣流速低時： H - u曲線與最佳流速： 由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數有一極小值。 以塔板高度H對應載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。 分子擴散項成為影響柱效的主要因素，隨著流速的增加，柱效提高，右圖曲線的坐邊。5、 分離度 塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。 難分離物質對

17、的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差色譜過程的熱力學因素； 區(qū)域寬度色譜過程的動力學因素。 色譜分離中的四種情況如圖所示： 柱效較高，K (分配系數)較大,完全分離； K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；柱效較低，K 較大,但分離的不好； K 小，柱效低，分離效果更差。分離度的表達式：R ：兩峰的分離程度可達89%；R ：分離程度98%；R ：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）。提高分離度有以下三種途徑：增加塔板數：增加柱長或降低塔板高度。增加選擇性：改變流動相的組成及pH改變柱溫改變固定相改變容量因子：可通過調節(jié)流動相的組成來實現。第一節(jié) 制備薄層色譜分離技

18、術制備色譜是指以色譜為手段從混合物中分離提純所需要的純化合物。 主要技術有薄層色譜:離心薄層、快速薄層制備柱色譜：干柱色譜、真空液相色譜；壓力液相色譜、逆流色譜等。一、薄層色譜條件固定相的選擇在制備色譜中應用較多的是以吸附劑為固定相的吸附色譜。固定相的選擇應從被分離物質極性和固定相的性能的強弱這兩方面考慮。被分離物質極性固定相性能/活性展開劑極性大弱（稍?。┐笮娦〕Ｓ梦絼┖喗?1) 硅膠：SiO2xH2O 是一種極性吸附劑，微帶酸性，適用于酸性物質及中性物質的分離。硅膠的吸附活性與其表面吸附的水的量有關，硅膠表面存在硅醇基，通過氫鍵與極性化合物結合，用于分離有機物，也可通過氫鍵與水結合，當

19、吸水大于12%時，則失去活性或吸附性，不能用作吸附色譜，只能用作分配色譜的載體。但加熱到100左右，此結合水能被可逆地除去，硅膠又恢復吸附能力。我們在制備薄層板后需進行活化，即為此目的。硅膠的分離效率取決于其顆粒大小和粒度分布范圍，顆粒大范圍寬效果差，但是展開快，斑點分散熒光硅膠：在硅膠中加入熒光劑，制成的薄層在紫外光照射下顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，呈暗色，從而可檢出斑點位置；這適用于那些本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當顯色劑顯色的化合物。熒光硅膠兩種，波長254nm和波長為365nm， GF254、GF365 、HF365、HF254等。 硅膠可用于吸附色譜，也可用于分配色譜。主

20、要區(qū)別在于活化程度不同，前者活化程度較高，后者低得多。反相硅膠：當硅膠表面的羥基被部分烷基化時，稱反相硅膠，其對物質吸附性恰好相反，對弱極性的物質具有吸附性（相似相容），用反相硅膠分離效果會大大提高。和正相相反，反相色譜常常被用于從極性溶液中或水相中分離非極性物質。非極性物質通過非極性官能團與固定相的相互作用被吸附在固定相的表面，一個非極性更大的溶劑將分析物從固定相上洗脫下來。常用的反相硅膠有C18、C8等。(2) 氧化鋁有三種類型：堿性氧化鋁（pH 9）、中性氧化鋁（pH 7）及酸性氧化鋁（）。它們都是由氫氧化鋁制得，但條件不同。活性與其含水量有關。目前除了生物堿等減性物質外，很少用。 (3

21、) 纖維素纖維素有兩種：天然纖維狀纖維素，簡稱纖維素，通常是用木材或廢棉經化學處理而制成微晶纖維素是用棉花等原料制成，纖維素分子由排列得比較規(guī)則的微小結晶區(qū)域（一般約占分子組成的 85）和分子排列雜亂的無定形區(qū)域交鏈而成，微晶纖維素的粒度為2040m。纖維素薄層主要適用于親水性物質的分離，用途與層析紙相似，但在相同條件下比紙層析的分離效果好。多用于分配色譜法。展開劑的選擇薄層色譜展開劑的選擇，主要根據樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度及吸附劑的活性等因素來考慮。溶劑的選擇可采用微量圓環(huán)技術，其方法為：將樣品溶液點于薄層板上，揮去溶劑，滴少量溶劑與薄層的斑點上，若樣品斑點未發(fā)生擴散或

22、位移，則需增加展開劑的極性或量，若樣品斑點向展開劑前沿快速擴散，則需降低展開劑的極性。石油醚環(huán)己烷四氯化碳甲苯苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇水冰醋酸。考察溶劑選擇的效果溶劑系統(tǒng)選好后，則可在制備薄層板上進行驗證并根據實驗結果進行進一步調整，以便達到分離的目的。薄層色譜的比移值（Rf值）可衡量分離效果。Rf的范圍在01。被分離物質的Rf值較理想的取值范圍。一般兩種物質的Rf時，足以使之分開。在一定條件下，特定化合物的Rf值為一個常數，因此可用于鑒別化合物。多元混合展開劑的應用在實際工作中常用兩種或三種溶劑按一定比例混合作展開劑 這樣分離的效果往往比單一的溶劑要好。多元混合展開劑中不同的溶劑

23、往往起著不同的作用。一般比例大的溶劑往往是起溶解待測組分和分離作用，占比例較小的溶劑起到調整改善分離物質的Rf值等。展開劑的選擇是一個摸索的過程，一般情況下，弱極性溶劑體系大多由石油醚、苯、環(huán)己烷等組成，適用于極性小的物質，實驗中可根據需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯調節(jié)溶劑的極性，以獲得較好的分離效果。中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離。 強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節(jié)，適合于極性很大的有機堿類化合物的分離，如生物堿的類化合物的分離。二、制備薄層色譜操作技術 鋪板活化點

24、樣展開（顯色）收集（定量分析、制備純樣品、定性檢出 ）1.薄層板的制備與活化：黏合劑有10%15%的煅石膏、0.2%0.7%的羧甲基纖維素鈉、5%的聚丙烯酸水溶液或5%的淀粉漿。硅膠薄層一般在105110活化3060min；氧化鋁薄層如果不加粘合劑，活化溫度可達150左右?；罨玫谋右欢ㄒ旁诟稍锵渲斜４?。因為吸附劑非常容易吸水，在50濕度的空氣中放置5min，可以吸收失去水分的50，10 min吸收 80。制備好的薄層板可現行用適當的溶劑進行預展開，以除去吸附的雜質。2.點樣：制備薄層一般采用條形上樣，樣品條的寬度為35 mm，距離薄層板底端大約2.5 cm，距薄層板兩側的邊距為13 mm

25、?？芍貜忘c樣，但須在前一次點樣干燥后。 3展開：上行和下行、單次和多次4顯色 ：必須是不破壞型，即不能用試劑顯色，可采用（1）碘蒸氣顯色（2）紫外線顯色若必須化學方法進行顯色，則也可用一玻璃板遮住中間部分，使其兩側各露出一小條，然后噴霧顯色。 5.收集：展開確定了所要的譜帶后，用適宜工具如刀片將所需成分的譜帶同吸附劑一起刮下，收集，選取適宜溶劑將所要組分洗脫下來，并清洗工具，合并洗脫液。將洗脫液收集，濃縮即可。如必要，可對收集物進行重結晶，以提高提取物的純度。制備薄層與常規(guī)薄層的區(qū)別薄板的厚度不同板的大小 分離的樣品量大 檢測必須是不破壞型，即不能用試劑顯色。樣品連同吸附劑一起刮下，放入燒杯中

26、（或裝入柱中）選用適當溶劑將組分洗脫出來。RPC是在TLC和柱色譜基礎上發(fā)展起來的，利用旋轉離心力，連續(xù)洗脫。涂有吸附劑薄層的轉子在旋轉過程中，在離心力的作用下，使溶劑在洗脫過程中，將樣品在吸附層被分離形成同心譜帶，使Rf值的差異加大，依次將不同組分的化合物，從轉子邊緣分離而出。三、離心薄層色譜和加壓薄層色譜離心薄層色譜 特點： 優(yōu)點：（1） 快速 30 min （2） 流動相少 （3） 可反復使用 （4） 進樣方便 （5） 直接洗脫 （6） 直接檢測，接收靈活 （7） 可梯度洗脫 （8） 經久耐用，占地小，移動方便 （9） 與普通制備薄層板相比，分離量大缺點：（1） 固定相限制 （2） Rf

27、值（3） 顯色（4） 收集污染（5） 上樣量少第二節(jié) 凝膠色譜分離技術及其應用凝膠色譜法（Gel Chromatograph GC）又稱凝膠過濾色譜GFC（Gel Filtration Chromatography）或空間排阻色譜法（SEC），亦稱分子排阻色譜法，系指利用多孔性凝膠填料的分子篩效應進行色譜分離的一種方法。一、 凝膠色譜分離的原理和分類 空間排阻理論：凝膠內部有許多孔隙 ，類似分子篩。當含有大、中和小不同尺寸分子的被分離組分溶液通過凝膠柱時，物質就依其分子的大小在凝膠上發(fā)生分離。組成待分離混合物的物質，以分子量遞減的順序先后離開柱床。 凝膠色譜按其流動相的不同分為兩大類：凝膠過濾

28、色譜(gel filtration chromatography，GFC)：以水或緩沖液做流動相，如硅膠和玻璃珠等無機填料、瓊脂糖凝膠、交聯葡聚糖凝膠等。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC) ：以有機溶劑做流動相，所用填料有聚苯乙烯凝膠、聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸甲酯凝膠等。主要適合于脂溶性高分子的分離。二、 凝膠的種類及性質 用于色譜分離的凝膠，除具有分離的特性外，還應滿足下列幾點要求：凝膠骨架在化學上必須是惰性的，即在分離過程中不應與被分離物質發(fā)生結合；凝膠的化學穩(wěn)定性好，應在很寬的pH和溫度范圍內不起化學變化，

29、不分解；凝膠本身應是中性物質，不含有（或僅含有最少量）能解離的基團，不會產生離子交換現象；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力（流速）。凝膠的種類：按材料來源可把凝膠分成有機凝膠與無機凝膠兩類按凝膠對溶劑的適應范圍可以把凝膠分成親水性、親油性和兩性凝膠三類。按機械性能分可分成軟膠、半硬膠和硬膠三類。 1. 交聯葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠是應用最廣的凝膠，構成的基本單位是葡聚糖，經交聯而成。葡聚糖凝膠表63 各型號交聯葡聚糖的性能型號顆粒大小/目干膠吸水量（mL/g干膠）干膠膨脹度（mL/g干膠）溶脹時間（h）2025分離范圍G-1040-2001.O0.1232至700G-154

30、01201.50.22.53.52至1500G-2520-801003002.50.02.50.2521005000G-5020801003005.O0.3107250010000G-7540-1207.50.5121572100050000G-10040-12010.O1.0152072500010000G-15040-12015.O1.52030725000150000G-20020.O2.030407250002000002. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠：骨架結構如圖所示。瓊脂糖主要來源于海藻，它是由交替的D-半乳糖和3，6-脫水半乳糖殘基構成的。瓊脂糖凝膠不能承受可以破壞氫鍵物質的作用表6

31、-4 瓊脂糖凝膠的性質商品名稱瓊脂糖濃度%分離范圍商品名稱瓊脂糖濃度%分離范圍Sepharose6B61044106Bio-GelA-50m21055107Sepharose4B461042107Bio-GelA-150m11061.5108Sepharose2B271044107Sagavac 10101042.5105Bio-GelA-0.5m101045105Sagavac 882.51047105Bio-GelA-1.5m81041.5106Sagavac 6651042106Bio-GelA-5m61045106Sagavac 4421041.5107Bio-GelA-15m4410

32、41.5107Sagavac 2251041.51083. 聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑交聯成的網狀聚合物，經干燥粉碎或加工成形制成顆粒狀干粉，遇水溶脹成凝膠?？刂平宦搫┑挠昧靠芍瞥筛鞣N型號的凝膠。表6-5 聚丙烯酰胺凝膠的性質聚丙烯酰胺凝膠吸水量膨脹體積分離范圍/相對分子質量浸泡時間/h（mL/g干凝膠）（mL/g干凝膠）20 100P-21.53.0100180042P-42.44.8800400042P-63.77.41000600042P-104.59.015002000042P-305.711.4250040000

33、123P-607.214.41000060000123P-1007.515.05000100000245P-1509.218.415000150000245P-20014.729.430000200000485P-30018.036.060000400000485三、凝膠特性參數 （1）排阻極限：是指不能擴散到凝膠網絡內部的最小分子的相對分子質量。不同的凝膠過濾介質具有不同的排阻極限。 （2）分級范圍：即能被凝膠阻滯，并且相互之間可以得到分離的溶質的相對分子質量范圍。（3）溶脹率：每克干凝膠所吸收的水分的百分數稱為溶脹率溶脹率= 100(溶脹處理平衡后重量一干燥重量)干燥重量A點一稱為凝膠的排

34、除極限，即大于A的分子被排阻在凝膠顆粒之外；B點一稱為滲透極限，即小于B的分子完全進入凝膠顆粒的徽孔中（4）柱體積：也稱床體積，即 1g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。也稱膨脹度。凝膠的床體積可用于估算裝滿一定體積的層析柱所需的干燥凝膠量。 （5）空隙體積：也稱外水體積，指層析柱中凝膠之間空隙的體積，即 V0值。（6）內孔體積 ：又稱內水體積,顆粒內部的空間即 Vi值 。（7）峰洗脫體積 ：是指被分離物質通過凝膠柱所需洗脫液的體積。四、凝膠色譜分離的步驟 (一) 色譜柱的選擇色譜柱是凝膠色譜技術的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。色譜柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。一般制備用的

35、凝膠柱，直徑大于2 cm，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，柱高一般不超過1 m。柱高與直徑的比一般稱為柱比。一般凝膠柱長2030 cm，柱比為（5：1）（10：1），凝膠床體積為樣品溶液體積的410倍。 (二) 凝膠的選擇作為固定相的凝膠，其材料性質、顆粒大小、孔徑、機械強度、化學穩(wěn)定性及其均一性等都對凝膠色譜分離的效果有重要的作用。一般選擇使用凝膠時應注意以下問題：混合物的分離程度主要決定于凝膠顆粒內部微孔的孔徑和混合物相對分子質量的分布范圍。凝膠的顆粒粗細與分離效果有直接關系。一般來說，細顆粒分

36、離效果好，但阻力大，流速慢；粗顆粒流速快，但會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平而寬。選擇合適的凝膠種類后，再根據色譜柱的體積和干膠的溶脹度（床體積/g干膠），計算出所需干膠的用量。(三) 溶劑的選擇考慮樣品的溶解能力和儀器的承受能力,盡可能采用純度高、毒性低、對樣品溶解性能好、粘度低及已知粘度參數的溶劑。水溶性物質的洗脫一般采用水或具有不同離子強度和pH值的緩沖溶液。(四) 凝膠色譜操作溶脹裝柱上樣洗脫再生G-75以下的凝膠需要泡1天，而G-100以上的型號需泡3天 攪拌下，緩緩地、均勻地、連續(xù)地加入已經脫氣的充分溶脹的凝膠懸浮液，同時打開柱端閥門 1.直接加樣至層析床表面 2.樣品液的加入量應掌握在

37、凝膠床總體積的510 控制速度五、凝膠色譜分離技術的應用與實例 分離純化 ：凝膠色譜可用于相對分子質量從幾百到106數量級的物質的分離純化，例如蛋白質、肽、脂質、抗生素、糖類、核酸及病毒（50400nm）的分離與分析。凝膠色譜還可用于醫(yī)藥產業(yè)中的生物制劑中抗原性雜質的除去。 例如：1青霉素純化2脫鹽 除去相對低分子質量物質。 例如，經過鹽析沉淀獲得的蛋白質溶液中鹽濃度很高，一般不能直接進行離子交換層析分離，可首先用GFC脫鹽。3. 多糖的分離 六、凝膠色譜分離技術的特點（1）溶質與介質不發(fā)生任何形式的相互作用，因此產品收率可接近100；（2）每批分離操作結束后不需要進行介質的再生，故容易實施循

38、環(huán)操作，提高產品純度；（3）作為脫鹽手段，凝膠色譜比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應力小，蛋白質活性收率高；（4）分離機理簡單，操作參數少，容易規(guī)模放大。第三節(jié) 高速逆流色譜分離技術逆流色譜（CCC）是以液相物質為固定相的液-液色譜，是一種特殊的連續(xù)萃取裝置。最早的逆流色譜是液滴逆流色譜（DCCC），后來發(fā)展了離心逆流色譜（CCCC）和高速逆流色譜（HSCCC）。特征是互不相溶的兩相在分離過程中做逆流運動，溶質組分由于在兩相中分配系數不同而得到分離。 已被應用于生化、生物工程、醫(yī)藥、天然產物化學、有機合成、環(huán)境分析、食品、地質、材料等領域。 一、簡介 1. 液滴逆流色譜（Drople

39、t Counter Current Chromatograph，DCCC） 液滴逆流色譜最大的弱點是可允許的流速太低，因此分離時間長，兩相混合差，相對來說，造成效率就低了。 離心液滴逆流色譜（Centrifugal planetary chromatograph,CPC）離心液滴逆流色譜比液滴逆流色譜進步的地方就是使用離心加快重力分離。 2. 高速逆流色譜（High-speed counter current chromatography，HSCCC）高速逆流色譜（HSCCC）利用了一種特殊的流體動力學（單向流體動力學平衡）現象，使兩個互不相溶的溶劑相在高速旋轉的螺旋管中單向分布。其中一相作固

40、定相，由恒流泵輸送載著樣品的流動相穿過固定相，利用樣品在兩相中分配系數的不同實現分離。 二、高速逆流色譜的原理與特點高速逆流色譜是一種建立在單向性流體動力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法。它利用了單向流體動力學平衡現象。高速逆流色譜是在旋轉運動中完成的，兩相溶劑都被劇烈振動的離心力場，依其界面特征甩成極微小的顆粒，樣品、各組分會在兩相微粒的極大表面上分配，并且能在顆粒振蕩與對流的環(huán)境中有效地傳遞。所以，它就象是把通常的溶劑萃取過程成千上萬次地、高效地、自動連續(xù)地完成。在逆流色譜中，留在管中固定相的量是影響溶質峰分離度的一個重要因素，高保留量將會大大改進峰分離度。當使螺旋管的轉速加快時，固定相

41、保留就會增多，分離效果也就越好，從而極大地提高了逆流色譜的分離速度，故將此法稱為“高速逆流色譜”，具有以下的特點：應用范圍廣，適應性好。操作簡便，容易掌握。重現性好，回收率高。分離效率高，分離量較大。產品純度高。三、高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇高速逆流色譜能否成功分離，溶劑系統(tǒng)的選擇非常重要。溶劑系統(tǒng)不僅要求兩相互不相溶，而且還要求它們有比較快的分離時間。溶劑系統(tǒng)的兩相可以是兩組分的，也可以是多組分的。溶劑系統(tǒng)通常通過下列兩個方面進行考察：分離組分在兩相中要有合適的分配系數。兩相溶劑系統(tǒng)的初步篩選一般情況下，兩相溶劑系統(tǒng)的初步篩選可首先通過薄層色譜法或者高效液相色譜法預測被分離物質的極性，然后根

42、據極性選擇合適的分離體系；也可以首先選出一個能使樣品全部溶解的溶劑體系，然后調整各溶劑的比例使得被分離組分滿足K值和的要求，以提高分離度。在實際工作中，如果通過實驗或文獻已知與被分離物質極性相似物質的分離體系，則可借鑒。如果被分離物質的極性都比較大，可以選用乙酸乙酯體系。該體系是高速逆流色譜分離常用的體系之一，屬強極性體系。一般由乙酸乙酯和水組成，并加入不同比例的甲醇、乙醇、正丁醇等作為極性調節(jié)劑，組成三元或四元溶劑體系。如果被分離物質一部分極性大，一部分極性中等可以選用中極性的氯仿體系。四、高速逆流色譜的操作過程及其應用實例實例6-2：高速逆流色譜在分離純化木蝴蝶中的黃酮苷類化合物的應用。實

43、例6-3：高速逆流色譜用于分離制備厚樸酚與和厚樸酚。第五節(jié) 制備柱色譜分離技術常壓柱色譜加壓柱色譜減壓柱色譜常壓柱層析 (0.1-50 g) （Ordinary Column Chromatograpy）1.色譜柱：玻璃或石英柱子的徑高比一般在1：51：20之間，對于易于分離的樣品，可以用相對短的柱子，而對于難分離的樣品，則可以用長柱子。 常壓柱色譜固定相 ：硅膠G、氧化鎂、氧化鋁、活性碳、聚酰胺等。一般要求吸附劑：有大的表面積和一定的吸附能力；顆粒均勻，不與被分離物質發(fā)生化學作用；對被分離的物質中各組份吸附能力不同 洗脫劑 ：根據被分離物質各組分的極性大小、在洗脫劑中溶解度大小進行選擇。極性

44、大的組份，選擇極性大的洗脫劑（如水、乙醇、氨等）；極性小的組份宜選用極性小的洗脫劑（如石油醚、乙醚等）。 易溶于洗脫劑中不易吸附于吸附劑上的組份，被脫的快，優(yōu)先隨洗脫劑被洗出來；不易溶于洗脫劑而易被吸附劑吸附的組份，被洗脫的速度慢，從而達到分離物質的目的實際上單純一種洗脫劑有時不能很好分離各組份，故常用幾種吸附劑按不同比例混合，配成最合適的洗脫劑 操作方法 柱層析操作過程：裝柱、加樣、洗脫、收集、鑒定五個步驟。1 裝柱 Al2O3：吸附劑 : 樣品 (2050 : 1) (20100 :1) Silica：吸附劑 : 樣品 (30100 : 1) (300400 :1) 1) 干法 與TLC吻

45、合度較好，溶劑消耗少 2) 濕法 緊密，前沿整齊 2 上樣 1) 濕法 溶劑溶解上樣（少量），低極性 2) 干法 低極性溶劑溶解性差 3 洗脫 常壓 、低壓、梯度洗脫（從低極性開始） 4 收集與檢查 TLC UV應注意不可使柱面暴露于空氣中 注意流速，不能太快二、加壓柱色譜（Pressure Liquid Chromtograpy）壓力液相色譜（PLC）泛指經加壓的色譜柱，以區(qū)別于靠自然重力分離的常壓開口柱，又稱快速色譜。 依據壓力將壓力液相色譜技術分類 低壓液相色譜（0.5 MPa），分離樣品5 g中壓液相色譜（2 MPa），1100 g高壓液相色譜（2 MPa）。1. 低壓制備色譜壓力通過

46、色譜柱頂部提供，常見的加壓手段有氮氣鋼瓶加壓、雙鏈球加壓、空氣加壓泵加壓及蠕動泵加壓。 壓力柱色譜的特點（1）設備簡單，操作容易，流動相由低壓（0.052 MPa）壓縮空氣或氮氣驅動，速度快，效率高。（2）可與薄層色譜配合使用。（3）在薄層上面Rf值的組分，在快速色譜柱上都可以很好地分開。（4）色譜柱的材質多為玻璃或石英，易于觀察洗脫狀態(tài)。2. 中壓色譜技術中壓色譜柱大多是由耐壓的強化玻璃制成，多數情況下，中壓色譜柱需由實驗人員自己填裝?？刹捎脻穹ɑ蚋煞ㄑb柱。在實際工作中，中壓制備色譜既可利用制備色譜儀來完成，也可根據研究需要由自己來組裝，其部件主要有：能提供幾十公斤壓力的橫流泵、色譜柱、檢測

47、器，而對于較完備的色譜裝置還配有自動分餾收集器和進樣閥。對于復雜的中藥提取物中有效成分的分離，在進行中壓色譜柱分離之前需進行預處理，如大空樹脂處理、萃取等。填裝好色譜柱后，將填裝好的色譜柱進行減壓或氮氣加壓，以便將色譜柱壓緊。干法裝柱可使固定相填裝密度至少提高20。表6-6 中壓制備色譜在各種天然藥物分離中的應用分離物質柱尺寸/mm填料流動相吲哚生物堿71318.5RP-18（40m）甲醇-乙睛-四氫呋喃-水生物堿糖苷10010RP-18（4063m）乙睛-水（24:76）色酮46026Diod己烷-乙酸乙酯（4:1）單萜46036RP-18（1525m）甲醇-水（65:35）三萜46050S

48、iO（3570m）二氯甲烷-甲醇-乙酸（110:8:3）3. 高壓制備液相色譜 高壓制備液相色譜具有柱效高、分離速度快等特點。與分析型制備色譜相比，其通量是分析型的幾百倍上千倍，制備型選用的是大流速的泵（數十毫升/min甚至上百毫升/min），5m以上的粗粒徑填料，實驗室用制備柱的粒徑一般為520m。色譜柱較分析型粗（分析型色譜柱的內徑一般為45mm），一般822mm，以提高柱子的載樣量。高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC

49、）。(1) 液液色譜-正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。 反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜法在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統(tǒng)計占整個HPLC應用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常為，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的p

50、H值會使鍵合的烷基脫落。C18和C8使用的pH值通常為，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。（2）離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。 分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽、高氯酸、三氟乙酸分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽等。 離子對色譜法常用ODS柱（即C18柱），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。 高壓制備型液相色

51、譜的樣品預處理由于制備色譜柱處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前處理就顯得非常的必要。萃取、過濾、結晶、固相萃取等簡單的分離方法均可作為樣品上柱前的預處理方法。由于顆粒狀雜質可能損壞高壓液相色譜儀的閥門，阻塞管道或柱入口端的濾板，所以在高壓液相色譜進樣之前，需對樣品進行過濾。用孔徑為2m之間，微孔濾膜過濾，常用。表6-7 HPLC在天然藥物分離制備中的應用分離物質色譜柱型號柱尺寸/mm流動相從大麥得到前花杏素RSL SiL C18HL（30m）5009水-醋酸從大豆得到異黃酮Partisil ODS-32509.4甲醇-水從Taxus media得到紫杉醇BondapakC18

52、（15m）30047乙睛-水（1:3）從藜屬植物奎藜軒得到皂苷TSK-gelODS-120T30021.5甲醇-水（68:32）三、減壓（真空）液相色譜在減壓情況下，使洗脫液快速通過固定相，達到快速分離的操作。真空液相色譜為間歇式操作，每洗脫一次則收集一個流分，可通過更換洗脫劑極性，使極性相近的成分得以分離。7.5 超臨界流體色譜（SFC）1 方法原理2 應用1 方法原理 超臨界流體色譜法是以超臨界流體作為流動相的一種色譜方法。 超臨界流體時指既不是氣體也不是液體的一些物質，它們的物理性質介于氣體和液體之間。（1）超臨界流體的特性（2）超臨界流體的色譜儀（3）壓力效應（4）固定相和流動相（5）

53、檢測器（1）超臨界流體的特性物質的臨界點超臨界流體的特性物質的臨界點 當處于臨界溫度下時，其氣體和液體具有相同的密度；當處于臨界溫度以上時，不管施加多大壓力，氣體也不液化流體。其密度隨溫度、壓力改變。超臨界流體的特性 超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的流動相，傳質阻力??；其密度與液相色譜的流動相類似；超臨界流體的其它物理性質和化學性質，都是密度的函數。超臨界流體的特性 只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質，從類似氣體到類似液體，無需通過氣液平衡曲線。超臨界流體程序升密度相當于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度洗脫。其高密度特性，使其具有足夠的溶解能力。（2）超臨界流體的色譜儀（3）壓力效

54、應在SFC中，壓力的變化對容量因子k值產生顯著影響，以超臨界流體作流動相，它的密度隨壓力的增加而增加，而密度的增加引起流動相溶劑效率的提高，同時可縮短淋洗時間。（4）固定相和流動相 用于SFC中的色譜柱可以是填充柱，也可以是毛細管柱。毛細管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有高的分離效率，倍受青睞。 流動相一般選擇CO2。（5）檢測器SFC可選擇高效液相色譜用檢測器，其一主要優(yōu)點可選擇GC中的FID(火焰離子化)檢測器，提高對有機物測定的靈敏度。2 應用 SFC測定分子質量范圍與LC相當。廣泛用于天然物、藥物、表面活性劑、高聚物、多聚物、農藥、炸藥、火箭推進劑等物質的分離和分析。 通常的色譜存在下列問題：(1)不能連續(xù)操作；(2)溶劑和分離材料利用率低；(3)流出組分被高度稀釋； SMB同樣的分離材料，生產力增加60倍，溶劑消耗量減少80倍。制備色譜技術7.6 模擬移動床色譜(SMB)模擬移動床色譜原理： 制備色譜技術 色譜對不同組分進行分離，主要是利用各種組分在色譜柱中的遷移速率不同來完成的考慮兩種組分A和B的分離，其中B比A更容易在固定相上吸附，因而B在色譜中遷移速率要比A小如果讓固定相以一個介于A，B兩種組分遷移速率之間的速度與溶劑作反向運動，這樣A，B兩種組分就會分別由固