生物制藥工藝學(xué)氨基酸類藥物-氨基酸的生產(chǎn)方法講義

1、第二章 氨基酸類藥物第二節(jié) 氨基酸的生產(chǎn)方法掌握直接發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的操作要點； 通過賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的工藝過程， 熟悉賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品的分離純化工藝過程教學(xué)基本內(nèi)容：2.2 直接發(fā)酵法直接發(fā)酵法的原理工業(yè)上， 發(fā)酵實質(zhì)上是利用微生物細胞中酶的作用， 將培養(yǎng)基中有機物轉(zhuǎn)化為細胞或其它有機物的過程。初生氨基酸： 微生物通過固氮作用、 硝酸還原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸，或微生物通過轉(zhuǎn)氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一種酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。次生氨基酸： 在微生物作用下， 以初生氨基酸為前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸。大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生物轉(zhuǎn)化

2、作用而產(chǎn)生。有些氨基酸可以以有機化合物和氨鹽為前體，在相應(yīng)酶作用下而產(chǎn)生。發(fā)酵法中氨基酸的碳鏈主要來自糖代謝中間產(chǎn)物，如草酰乙酸、a -酮戊二酸、赤蘚糖-4- 磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、 3-磷酸甘油酸及分枝酸等。直接發(fā)酵法分類按照生產(chǎn)菌株的特性，直接發(fā)酵法可分為 5 類：使用野生型菌株直接由糖和銨鹽發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和纈氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)；使用營養(yǎng)缺陷型突變株直接由糖和銨鹽發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，如賴氨酸（高絲氨酸缺陷） 、亮氨酸（苯丙氨酸缺陷）等；由氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株生產(chǎn)氨基酸，如賴氨酸（ S- （ 2- 氨基乙酸）-L-半胱氨酸（AEC）等；使用營養(yǎng)缺陷型兼抗性突變株生產(chǎn)氨

3、基酸，如高絲氨酸（蛋氨酸、賴氨酸缺陷，a-氨基-伊羥基戊酸AHV抗性）等；以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸，這一方法主要用于很難避開其反饋調(diào)節(jié)機制，而難以用直接發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸。如現(xiàn)已成功地用鄰氨基苯甲酸作為前體物生產(chǎn)L- 色氨酸，用甘氨酸作為前體工業(yè)化生產(chǎn)L-絲氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的基本過程包括培養(yǎng)基配制與滅菌處理，菌種誘變與選育，菌種培養(yǎng)、滅菌及接種發(fā)酵，產(chǎn)品提取及分離純化等步驟。（二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝構(gòu)成動物、植物及微生物體所有蛋白質(zhì)的氨基酸種類與構(gòu)型均無任何差異，但植物體內(nèi)所有氨基酸皆由 CO2 、氨和水合成，動物體除8 種必需氨基酸需從外界攝取

4、外，其余非必需氨基酸均可通過體內(nèi)氨基酸之間的轉(zhuǎn)化或碳水化合物中間代謝物而合成，而微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。目前絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn)， 其缺點是產(chǎn)物濃度低， 設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴格，生產(chǎn)周期長，成本高。本文僅以 L- 異亮氨酸及L- 賴氨酸直接發(fā)酵法為例，說明發(fā)酵法的基本過程。1、L-異亮氨酸（L-Isoleucine , L-Ile ）的制備1 ） L- 異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)： L-Ile 存在子所有蛋白質(zhì)中， 為人體必需氨基酸之一，分子式為 C6H13NO2 ，分子量為 131.17 ，結(jié)構(gòu)式為：3 ）工藝過程菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（% ）為：葡萄糖2

5、 尿素 0.3 玉米漿2.5豆餅水解液0.1 （以干豆餅計） pH6.5 。二級種子培養(yǎng)基另加菜籽油 0.4 ，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)： 1000ml 三解瓶中培養(yǎng)基裝量為 200ml ， 接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30c培養(yǎng)（沖程7cm ,頻率105次/min） 16h。二級種子培養(yǎng)： 接種量 3.5， 培養(yǎng) 8h ， 如此逐級放大培養(yǎng)得足夠量菌種。滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（% ）為 :硫酸銨4.5 豆餅水解液0.4 ，玉米漿2.0碳酸鈣4.5pH7.2 ，淀粉水解還原糖初糖濃度11.5 。在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118120C,維持在1.1 x

6、i05Pa壓力，滅菌30min ,立即通冰鹽水冷卻至 25 C。接入1%菌種（v/ v）,維持180轉(zhuǎn)/min的攪拌速度，升溫至 3031 C,以0.2L/ （ min ?L） 通氣量發(fā)酵60h ,在2450h之間不斷補加尿素至0.6,氨水至0.27。除菌體、酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100 并維持 10min ，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5 ，過濾除沉淀。離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5 %的流速進H十-型732離子交換柱（40 X100cm ),以100L去離子水洗柱，再以60C、0.5mol /L氨水按3L/min 的流 速進行洗脫，分部收集洗脫液。濃縮趕氨

7、合并pH312的洗脫液，7080 c減壓蒸儲、濃縮至粘稠狀，加去離子水至原體積的1 4 ，再濃縮至粘稠狀。如此重復(fù)三次。脫色、濃縮、中和上述濃縮物加去離子水至原體積的1 4 ，攪拌均勻，加2mol L 鹽酸調(diào)pH3.5 ,加上1% (w/v)活性炭，70 c攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當體積，用 2mol L 氨水調(diào) pH6.0 ， 5 沉淀過夜,過濾抽千， 105 烘干得：L- 異亮氨酸半成品。精制、烘干每10kg L-異亮氨酸半成品加8L濃鹽酸和20L去離子水，加熱至80 C,攪拌溶解，加10kg 氯化鈉至飽和，加工業(yè)液堿調(diào) pH10.5 ，過濾，濾液用堿調(diào)pH 1.5 ，

8、5 放置過夜。濾取沉淀，用80L ，去離子水加熱至80 攪拌溶解，加適量氯化鈉和1% (w/v)活性炭，70 c攪拌脫色lh過濾，濾液減壓濃縮至適當濃度，用氨水調(diào) pH6.0 ， 5放置結(jié)晶過夜。次日過濾收集結(jié)晶，抽干，于105 c烘房中烘干得L-異亮氨酸成品。( 4 )檢驗應(yīng)為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應(yīng)為98.5 %101.5 %,干燥失重不超過0.3 ，熾灼殘渣不大于含量測定與L- 亮氨酸的規(guī)定相同。0.3% ， 氯化物不超過0.05 ， 硫酸鹽不超過0.03 ， 鐵鹽不超過0.003 ,重金屬不超過0.0015 ，砷鹽不超過1.5ppm 。5 ） 作用與用途 L-Ile 為必需氨基酸，

9、 是復(fù)方氨基酸輸液的重要成份之一。2 、 L- 賴氨酸（L-Lysine ， L-Lys ）的制備L-賴氨酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) L-賴氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一。分子量為 146.20 ，結(jié)構(gòu)為：菌種培養(yǎng)滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為淀粉水解糖13.5 ，磷酸二氫鉀0.1 ，硫酸鎂 0.05 ，硫酸銨 1.2 ，尿素 0.4 ，玉米漿1.0 ，毛發(fā)水解廢液1.0 ，甘蔗糖蜜 2.0 ， pH6.7 ，滅菌前加甘油聚醚lL （指5m3 發(fā)酵罐） 。在 5m3 發(fā)酵罐中投入培養(yǎng)液3噸，在1.01 xi05Pa壓力下，加熱至118120 c滅菌30min , 立即通入冰鹽水冷卻至30 C

10、,按10% （v/v）比例接種，以1:0.6 （v/v）通 氣量于30c發(fā)酵4251h ,攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min。發(fā)酵液處理：離心除菌體； 80 加熱；離子交換：錢型732樹脂;PH=5.0為飽和（串聯(lián)）濃縮結(jié)晶：收集pH=8.014.0洗脫液（氨水洗脫）發(fā)酵法的基本過程發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的基本過程包括菌種誘變與選育，培養(yǎng)基配制與滅菌處理，菌種培養(yǎng)、接種發(fā)酵，產(chǎn)品提取及分離純化等步驟。氨基酸發(fā)酵方式主要是液體通風(fēng)深層培養(yǎng)法，其過程是由菌種試管培養(yǎng)逐級放大直至數(shù)噸至數(shù)百噸發(fā)酵罐。 發(fā)酵結(jié)束， 除去菌體， 清液用于提取、 分離純 化和精制有關(guān)氨基酸，其分離純化、精制方法及過程與水解法相同。直接發(fā)

11、酵法實例指通過特定微生物在以糖為碳源、以氨或尿素為氮源以及其它成分的培養(yǎng)基中生長，直接產(chǎn)生氨基酸的方法。L-異亮氨酸的制備工藝流程1 ）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（）為：葡萄糖2 ，尿素 0.3 ，玉米漿 2.5 ，豆餅水解液0.1 ， pH6.5 。二級種子培養(yǎng)基加菜籽油，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)： 1000ml 三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為 200ml ， 牛肉膏斜面， 接種一環(huán) AS1.998 菌種，搖床30、 16h 。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5，培養(yǎng) 8h 。逐級放大。2 ）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（） ：硫酸銨 4.5 ，豆餅水解液0.4 ，玉米漿2.0 ，碳酸鈣4.5， pH7.

12、2 ，淀粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種 1 菌種（ v/v ） ，攪拌，發(fā)酵。3 ）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100 并維持 10min ，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5 ，過濾除沉淀。4 ）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5 %的流速進H+型732離子交換柱（640 X100cm）, 以 100L 去離子水洗柱，再以 60,0.5mol/L 氨水按 3L/min 的流速 進行洗脫。分部收集洗脫液。5 ）濃縮趕氨6 ）脫色、濃縮、中和7 ）精制，烘干2.2.5 工藝過程評價微生物利用碳源、 氮源及鹽類通過發(fā)酵法幾乎可合成所有氨基酸。 該法的缺點是產(chǎn)物

13、濃度低，設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴格，生產(chǎn)周期長，成本高。2.3 酶法轉(zhuǎn)化概述酶法是應(yīng)用完整的菌體或自微生物細胞提取的酶類制備氨基酸的方法。賴氨酸、色氨酸等均可用酶法進行制備。在發(fā)酵工業(yè)中早在1973 年就用固定化菌體的方法生產(chǎn)天冬氨酸。將酶或細胞進行固定化處理，再將固定化酶或細胞裝填于適當反應(yīng)器中制成所謂“生物反應(yīng)堆” ，加入相應(yīng)底物合成特定氨基酸，反應(yīng)液經(jīng)分離純化即得相應(yīng)氨基酸成品。其分離純化和精制的原則及方法與水解法相同。酶工程法與直接發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸之反應(yīng)本質(zhì)相同， 都屬酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 但前者為單酶或多酶的高密度轉(zhuǎn)化，而后者為多酶低密度轉(zhuǎn)化。兩者相比，酶工程技術(shù)工藝簡單， 產(chǎn)物濃度高，

14、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率較高， 副產(chǎn)物少， 固定化酶或細胞可進行連續(xù)操作，節(jié)省能源和勞務(wù)，并可長期反復(fù)使用。如聚丙烯酰胺凝膠包埋的精氨酸脫亞胺酶用于生產(chǎn) L-瓜氨酸，37 c反應(yīng)半衰期為140天，可連續(xù)使用 300 天。固定化酶凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)的使用的酶都稱為固定化酶。通常采用的固定化方法可大體概括為四種類型： 吸附法、 共價偶聯(lián)法、 交聯(lián)法和包埋法。吸附法 這是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法，又可分：物理吸附和離子交換吸附物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和冗-電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。常用的載體有： 皂土、 硅膠、 氧化鋁、 磷酸

15、鈣膠和微孔玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原、賽珞玢以及火棉膠等有機吸附劑。最常用的交換劑有CM （羧甲基）纖維素、DEAE （二乙基氨基乙基）纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑，約50150mg蛋白/g載體。共價偶聯(lián)法這是借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。常用的載體有：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐共聚物、 聚苯乙烯、 尼龍等； 還有無機載體如多孔玻璃等。交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶分子與惰性蛋白間、或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)以共價鍵制備固定化酶。包埋法將聚合

16、物的單體和酶溶液混合后， 再借助聚合促進劑 （包括交聯(lián)劑） 的作用進行聚合，將酶包埋于聚合物中以達到固定化的目的。（ 1 ）膠格包埋最常用的包埋劑是聚丙烯酰胺凝膠，它以丙烯酰胺為單體、N, N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合而成。（ 2 ） 微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、 厚約 25nm 的半透膜將酶分子進行包埋固定化的方法。（ 3 ）脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包裹空間的微球體。輔酶及偶聯(lián)酶的固定化輔酶物質(zhì)的固定化一般采用載體共價偶聯(lián)法。2.3.2 實例天冬氨酸和丙氨酸的制備工藝過程菌種培養(yǎng)大腸桿菌（ Esscherichia coli ） AS1.881 的培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基為

17、普通肉汁培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基成分 （） 為玉米漿 7.5 ， 反丁烯二酸2.0 ， MgSO4 ?7H2O0.02 ，氨水調(diào)pH6.0,煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量50100m1。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子， 接種于搖瓶培養(yǎng)基中， 37 振搖培養(yǎng)24h ，逐級擴大培養(yǎng)至10002000L規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol /L HCl調(diào)pH5.0 ,升溫至 45并保溫 1h ，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)筒式高速離心機收集菌體（含天冬氨酸酶） ，備用。德阿昆哈假單胞菌（ Pseudomonas dacunhae ） 68 變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（）為蛋白胨 0.25 ，牛肉膏 0.52 ，酵母膏

18、0.25 ， NaC1 0.5 ， pH7.0 ，瓊脂 2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基相同，唯不加瓊脂， 250ml 三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為 40m1 。搖瓶培養(yǎng)基組成（）為L-谷氨酸3.0,蛋白陳0.9,酪蛋白水解液0.5,磷酸二氯鉀 0.05 ， MgSO4 ?7H2O 0.01 ，用氨水調(diào) pH 7.2 ， 500ml 三角瓶中培養(yǎng)基裝量為 80ml 。將培養(yǎng) 24h 的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中， 30振搖培養(yǎng)8h ， 再接種子搖瓶培養(yǎng)基中，30 c振蕩培養(yǎng)24h,如此逐級擴大至10002000L的培養(yǎng)罐培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后用 1mol LHCl 調(diào) pH 至 4.75 ，于 30保溫

19、 1h ，用轉(zhuǎn)筒式高速離心機離心收集菌體（含 L-天冬氨酸-伊脫竣酶），備用。細胞固定E?coli 的細胞固定取濕菌體 20kg 懸浮于 80L ，生理鹽水（或離心后的培養(yǎng)清液） 中， 保溫至 40， 再加入 90L 保溫至 40的 12明膠溶液及10L1.0 戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固，再漫于0.25 戊二醛溶液中。于5c過夜后，切成35mm的立方小塊，浸于0.25 %戊二醛溶液中5c過夜、蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶的固定化 E.coli ，備用。假單胞菌體固定取濕菌體 20kg ，加生理鹽水攪勻并稀釋至 40L ，另取溶于生理鹽水的 5 角叉菜膠溶液85L ，兩液均保溫

20、至45 后混合，冷卻至5 成膠。浸于600L2%KCl 和 0.2mol L 己二胺的 0.5mol L pH7.0 的磷酸緩沖液中，5下攪拌10分鐘，加戊二醛至0.6mol /L濃度，5c攪拌30分鐘，取出切成35mm 的立方小塊， 用 2% KCl 溶液充分洗滌后， 濾去洗滌液， 即得含L- 天冬氨酸-伊脫竣酶的固定化細胞，備用。轉(zhuǎn)化反應(yīng)將保溫至37c的lmol /L延胡索酸錢（含1mmol /L MgC12 , pH8.5 ）底物溶液按一定空間速度（Sv）連續(xù)流過生物反應(yīng)堆I,控制達到最大轉(zhuǎn)化率（95%）為限度，收集轉(zhuǎn)化液制備 L-Asp或用于生物反應(yīng)堆II的再轉(zhuǎn)化。當需要生產(chǎn)L-丙氨酸

21、時，向上述轉(zhuǎn)化液中加磷酸叱哆醛至0.1mmol /L濃度，調(diào)pH6.0 ,保溫至37 C,按一定空間速度流入1.515 xl05Pa壓力下的生物反應(yīng)堆控制達到最大轉(zhuǎn)化率（ 95%）為限，收集轉(zhuǎn)化液，用于制取 L- 丙氨酸。5）產(chǎn)品純化與精制生物反應(yīng)堆I轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清，攪拌下用 1mol /L HCl調(diào)pH2.8 , 5 C結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌抽干， 105 干燥得 L-Asp 粗品。粗品用稀氨水溶解（pH5 ） 成 15 溶液， 加 1%（wv） 活性炭， 70攪拌脫色1h過濾 ,濾液于 5 結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶， 85真空干燥得藥用 L-Asp 。生物反應(yīng)堆II轉(zhuǎn)化液過濾澄清，

22、于6070 c下減壓濃縮至原體積的50 % ,冷卻后加等體積甲醇，5結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶并用少量冷甲醇洗滌抽干， 80 真空干燥得L-Ala 粗品。 粗品用 3 倍體積（wv） 去離子水于80 攪拌溶解，加 0.5% （wv） 藥用活性炭于70攪拌脫色1h ， 過濾， 濾液冷后加等體積甲醇，5結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，于80真空干燥得藥用L Ala 。5 ）檢驗6 ）作用與用途 L-Asp 有助于鳥氨酸循環(huán)，促進氨和 CO2 生成尿素，降低血中氨和 CO2, 增強肝功能，消除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同時 L-Asp 和 L-Ala 都是復(fù)合氨基酸輸液的原料。2.3.3 酶法轉(zhuǎn)化工藝評

23、價（ 1）酶法是利用微生物特定的酶系作為催化劑，使底物經(jīng)過酶催化生成所需的產(chǎn)品，由于底物選擇的多樣性，因而不限于制備天然產(chǎn)品。借助于酶的生物催化，可使許多本來難以用發(fā)酵法或合成法制備的光學(xué)活性氨基酸，有工業(yè)生產(chǎn)的可能。雖然酶法生產(chǎn)氨基酸具有工藝簡單、 周期短、 耗能低、 專一性強、 收率高等特點，但要將它們應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，還需要進一步的研究。如何獲得廉價的合成底物和酶原是這一方法能否成功的關(guān)鍵。近年來，隨著基因重組技術(shù)的進步，使酶法生產(chǎn)氨基酸技術(shù)更具有光明的前景。酶拆分法制備L-苯丙氨酸L-苯丙氨酸(L-phenylalanine , L-phe )的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-phe ,存在于所有蛋白

24、質(zhì)中， 為人體必需氨基酸之一， 其分子式為 C9H11NO2 ， 分子量為165.19 ，結(jié)構(gòu)為：酶拆分 DL-Phe 的原理： DL-Phe 與醋酸酐反應(yīng)生成乙酰-DL-Phe (Ac-DL-Phe) ， 氨基?；缚蓪Ｒ恍运釧c-L-Phe 的酰胺鍵生成L-Phe ， 而不水解 Ac-D-Phe 酰胺鍵，再利用 L-Phe 與 Ac-D-Phe 在水中溶解度的差異進行分離。Ac-D-Phe 又可經(jīng)消旋生成Ac-DL-Phe ， 再行水解和分離， 如此反復(fù)進行，可將 DL-Phe 全部轉(zhuǎn)化為 L-Phe 。 DL-Phe 拆分的基本反應(yīng)過程如下：固定化氨基?；傅闹苽淙?DEAE-Seph

25、adex A-50 于去離子水中充分浸泡后，依次用 10 倍量 0.5mol L HCl 和 0.5mol L NaOH 溶液攪拌處理30min ，再用去離子水洗至中性，然后依次用 0.1mol L 及 0.01mol L 的pH7.0磷酸緩沖液處理12h,濾干備用。另取培養(yǎng)4050h的米曲擴大曲用6倍量去離子水分兩次抽提，濾去殘渣。濾液用 2mol L NaOH 溶液調(diào) pH6.77.0 ，按 100L 酶液加 1kg 已處理的濕DEAE-SephadexA-50 的比例混合，于 04c攪拌吸附45h,濾取DEAE-Sephadex A-50，依次用去離子水、0.1mol /L 醋酸鈉、0.

26、01mol /L 的 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌34次，濾干得固定化氨基?；?，加1 %甲苯后于冷庫中貯存，備用。Ac-DL-Phe的制備 將DL-Phe、冰醋酸及醋酸酊按1 ：7：1 (w/V/v) 的比例加入反應(yīng)釜中，90 c反應(yīng)45h ,回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水， 再濃縮至一定體積，冷卻結(jié)晶，濾取結(jié)晶于60 真空干燥得Ac DL Phe 。酶水解在 1000L 反應(yīng)罐中加700L 0.1mol L Ac-DL-Phe 鈉鹽溶液，攪拌下滴加6mol /L HCl至pH6.77.0 ,加1520kg固定化氨基?；?，50 c反應(yīng)4 5h ，過濾，濾液待分離L Phe ，固定化酶再用于

27、轉(zhuǎn)化。分離純化 上述濾液用6mol /L HCl調(diào)至pH4.85.1 ,減壓濃縮至35L 左右， 濃縮液于0 結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶并用 10L 冷乙醇洗滌三次， 抽干 ,于 80烘 34h ， 得 L Phe 粗品。 濾液和洗滌液合并后減壓濃縮至20L 左右， 得 Ac-D-Phe 溶液，待消旋和再轉(zhuǎn)化。精制 取 50L 去離子水于100L 反應(yīng)罐中，加熱至95100 ，投入 5kgL Phe 粗品，攪拌溶解，加藥用活性炭0.25kg ，攪拌脫色3min 。趁熱過濾，濾液轉(zhuǎn)移至200L 結(jié)晶罐中， 冷卻至 40， 加 50 L 40 95乙醇， 用 6mol/L HCl調(diào)pH5.5 ,于0 c結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，用10L冷乙醇洗滌34次, 抽干，于80 c干燥34h。母液濃縮回收L-Phe結(jié)晶，所得結(jié)晶如上法重結(jié)晶 一次， 得藥用 L Phe 。 結(jié)晶母液及洗滌液合并,減壓濃縮后轉(zhuǎn)入粗品母液， 待