微生物大小的測定及顯微鏡直接計數(shù)法

1、微生物學(xué)實驗報告姓名年級班級組別一組同組者科目微生物題目微生物大小和數(shù)量的測定儀器編號一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握使用顯微鏡測微尺測定微生物大小的方法。了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、明確其計數(shù)原理。學(xué)習(xí)并掌握使用血球計數(shù)板測定微生物細(xì)胞或抱子數(shù)量的方法。二、基本原理顯微測微尺可用于測量微生物細(xì)胞或抱子的大小，包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺兩個部件。鏡臺測微尺全長1mm，等分為100格，每格0.01mm。用于校正目鏡測微尺沒小哥的長度目鏡測微尺其中央刻有50等分或100等分的小格測量前應(yīng)預(yù)先用鏡臺測微尺來校正并計算出在某一放大鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度，再以后作為測量微生物細(xì)胞的長度.目鏡測微尺每格長

2、度（Um）=（兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)xlO）/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)圖一：測微尺的校正3.顯微直接計數(shù)法：將小量待測樣品懸浮液置于計菌器上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。顯微計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌抱子等。菌體較大的酵母菌或霉菌抱子可采用血球計數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計數(shù)板或Hawksley計數(shù)板。三種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間較寬

3、的平臺，被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)（大方格）分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。計數(shù)區(qū)由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常測定五個中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16,就得到一個大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設(shè)5個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，貝U：AImL菌液中的總菌數(shù)=5x25x

4、l04xB=5xl04xAB（25個中格）A=5x16x104xB=3.2x104xAB（16個中格）三、實驗器材1、菌種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),枯草芽抱桿菌(Bacillussubitilis)2、溶液與試劑0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，蒸餾水。3、儀器及其他用品目鏡測微尺，鏡臺測微尺，普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙；血細(xì)胞計數(shù)板、移液管，小玻璃珠，燒杯，錐形瓶等四、操作步驟微生物大小的測定。目鏡測微尺的安裝把右目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。校正目鏡測微尺將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有

5、刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，利用推進(jìn)器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)(圖一)。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于已知鏡臺測微尺每格長10ym，根據(jù)下列公式即可分別計算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度(ym)=兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)X1O兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)菌體大小的測定制作枯草芽抱桿菌的單染色制片洗片干燥加熱、固定、干燥結(jié)晶紫染

6、色2min自然干燥制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美藍(lán)f接種酵母菌f蓋蓋玻片將鏡臺測微尺取下,換上細(xì)菌制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。同一種群中的不同菌體細(xì)胞之間也存在個體差異，因此在測定每一種菌種細(xì)胞大小時應(yīng)對多個細(xì)胞進(jìn)行測量，然后計算取平均值。顯微鏡計數(shù)。血球計數(shù)板清洗。自然干燥。對酵母菌液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?。取原?mL到試管中，用移液管移取9mL水注入試管中。再取上一次稀釋的菌液中的1mL加到另一支試管中，加9mL水。依此類推。即可得到一系列稀釋梯度的菌液。加樣品

7、。血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，從計數(shù)板平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一滴，利用表面張力溝槽中流出多余的菌懸液。加樣后靜置5min，使細(xì)胞或抱子自然沉降。將加有樣品的血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計數(shù)。若發(fā)現(xiàn)菌液太濃，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)有不多于8個個菌體。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進(jìn)行計數(shù)。若有菌體位于格線上，則計數(shù)原則為計上不計下，計左不計右。如遇酵母出芽，芽體全記或全不計。清洗。使用完畢后，將血球計數(shù)板及蓋玻片進(jìn)行清洗、干燥，放回盒中，以備下

8、次使用。五、注意事項使用鏡臺測微尺進(jìn)行校正時，若一時無法直接找到測微尺，可先對刻尺外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)焦后再通過移動標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。細(xì)菌的個體微小，在進(jìn)行細(xì)胞大小測定時一般應(yīng)選用油鏡，以減小誤差。進(jìn)行顯微鏡計數(shù)時應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計數(shù)。酵母菌計數(shù)加樣品前，一定將菌液搖勻。為了確定稀釋梯度，可以先將酵母菌的原液加到計數(shù)板上計數(shù)。六、實驗結(jié)果1.目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺代表的長度/“m低倍鏡10303010高倍鏡4093232.473油鏡1001001012、微生物大小測定結(jié)果表1枯草芽抱桿菌大

9、小測定記錄（單位:油鏡下目鏡測微尺格數(shù)）123平均長度3.01.85.03.27寬度1.01.21.01.07表2釀酒酵母大小測定記錄（單位:40倍目鏡測微尺格數(shù)）123平均長度3.132.93寬度2.12.522.2表3各菌測定結(jié)果名稱目鏡測微尺母格代表的長度（m）長寬菌體大小/長X寬（JmXjm）目鏡測微尺平均格數(shù)長度/|Jm目鏡測微尺平均格數(shù)寬度/Jm枯草芽抱桿菌13.273.271.071.073.27X1.07釀酒酵母2.47337.4192.25.4417.419X5.4413、酵母菌顯微計數(shù)結(jié)果（A表示5個中格中總菌數(shù)，B表示菌液稀釋倍數(shù)）酵母菌數(shù)量的測定結(jié)果菌種AB菌數(shù)/mL酵

10、母菌202101.01X108七、思考題和小結(jié)為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行校正？答：因為在不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡下，目鏡測微尺每格代表的長度會發(fā)生變化。在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細(xì)菌的大小時，其測定結(jié)果是否相同？為什么？答：相同。因為用不同的物鏡時都重新校正目鏡測微尺，目鏡測微尺每格代表的長度可按照重新校正的數(shù)據(jù)計算。哪些因素會造成血球計數(shù)板的計數(shù)誤差，應(yīng)如何避免？答：器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確，細(xì)胞識別錯誤等因素所造成的誤差；由于儀器（計數(shù)板、蓋片、吸管等）不夠準(zhǔn)確與精密帶來的誤差；由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來的細(xì)胞計數(shù)誤差。前兩者可通過規(guī)范操作、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正；細(xì)胞分布誤差可通過多次計數(shù)取平均值來減小。小結(jié)本次實驗中，我們學(xué)習(xí)了如何使用顯微測微尺測量細(xì)胞大小和使用血細(xì)胞平板計數(shù)法測量微生物的數(shù)量