中樞酸敏感離子通道對家兔呼吸活動調(diào)節(jié)的影響-復(fù)旦學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)院版(共12頁)

1、中樞酸敏感離子通道對家兔呼吸(hx)活動調(diào)節(jié)的影響楊達(dá)偉1 張函1 陶雪飛1 陳玨偉1 宋娜娜(n n)2 沈霖霖2(1復(fù)旦大學(xué)(f dn d xu)中山醫(yī)院；2生理與病理生理學(xué)系 上海 200032)【摘要】目的 觀察中樞pH值改變對家兔呼吸活動調(diào)節(jié)的影響。方法 8只烏拉坦麻醉的成年家兔，記錄膈神經(jīng)放電信號，同時記錄心電活動；一側(cè)側(cè)腦室微量注射不同pH的酸化人工腦脊液（pH=7.4、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0，20L）及酸敏感離子通道的阻斷劑（Amiloride），NMDA受體激動劑（NMDA）和阻斷劑（MK-801）。分析呼吸的頻率、膈神經(jīng)放電的積分面積和心率的改變。結(jié)果 （1

2、）側(cè)腦室微量注射不同pH 值的酸化腦脊液后，家兔呼吸頻率顯著增加，于pH 5.0達(dá)到最大效應(yīng)，但在pH 4.0時呼吸頻率的增加減弱。膈神經(jīng)放電的積分面積與心率無明顯變化。（2）側(cè)腦室微量注射Amiloride后，酸化腦脊液引起家兔呼吸活動的興奮作用減弱（P0.01, P0.05）。（3）側(cè)腦室微量注射MK-801后，酸化腦脊液引起家兔呼吸活動的興奮作用減弱，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。微量注射NMDA后，酸化腦脊液引起家兔呼吸活動的興奮作用增加（P0.05）。結(jié)論 家兔呼吸頻率與側(cè)腦室內(nèi)pH值呈反向U型劑量關(guān)系，效應(yīng)在pH 5.0時達(dá)頂峰。酸敏感離子通道的直接阻斷劑Amiloride可以有效抑制酸化對呼

3、吸中樞的興奮作用，提示氫離子介導(dǎo)的呼吸中樞興奮的調(diào)節(jié)機(jī)制與酸敏感離子通道有關(guān)。NMDA增加氫離子興奮呼吸中樞的作用和NMDA受體阻斷劑MK-801抑制氫離子興奮呼吸中樞的作用，提示上游興奮性氨基酸受體可能參與對酸敏感離子通道的調(diào)節(jié)?！娟P(guān)鍵詞】酸敏感離子通道；酸化人工腦脊液；Amiloride；NMDA；MK-801；膈神經(jīng)【中圖分類號】 Q473 【文獻(xiàn)(wnxin)標(biāo)識碼】 AEffects of central acid sensing ion channels on modulation of respiratory activity in rabbitsYANG Da-wei 1 ZH

4、ANG Han 1 TAO Xue-fei 1 CHEN Jue-wei 1 SONG Na-na 2 SHEN Lin-lin 2(1 Clinical Medicine; 2Department of Physiology and Pathophysiology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)【Abstract】Objective Present study investigated the effect of different pH artificial cerebrospinal

5、 fluid (ACSF) on modulation of respiratory activity in rabbits. Methods Experiment was performed on adult rabbits (n=8) with urethane anesthetized. The phrenic nerve discharge (PND) and electrocardiogram (ECG) were recorded simultaneously. Respiratory rate (RR) and integral value of PND were calcula

6、ted from PND recording. Heart rate (HR) was calculated from ECG. Acidic ACSF (pH=7.4, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.0, 20l) and antagonist of ASICs or NMDA were microinjected into lateral ventricle (LV) in medulla. Results (1) Microinjection of acidic ACSF induced a rise in RR compared to normal saline with

7、out change of PND and HR. The response peak of RR was at pH 5.0. However it was less at pH 4.0 than at pH 5.0. (2) Amiloride, direct antagonist of ASICs, attenuated the RR response to acidic ACSF at pH 5.0 (P0.01, P0.05). (3) MK-801, indirect antagonist of ASICs, also showed the trend of decreasing

8、on RR without significance. NMDA increased the RR responding to acidic ACSF (P0.05). Conclusions The data indicates an inversely U-shape does-response relationship between central pH concentration and respiratory rate. The response peak of RR was at pH 5.0. Effect of Amiloride indicates that ASICs a

9、re involved in modulation of respiration. It may also suggest that NMDA is one of the participation of ASICs signaling mechanism.【Key Words】acid sensing ion channel (ASIC); acidic artificial cerebrospinal fluid (AACSF); Amiloride; NMDA; MK-801; phrenic nerve自從(zcng)Waldmann等1在1997年克隆了第一個酸敏感離子通道(acid

10、 sensing ion channels, ASICs)亞基后，對ASICs的研究成為近幾年來生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)中發(fā)展(fzhn)最為迅速的領(lǐng)域之一。ASICs通道屬于鈉離子通道/退化蛋白（Na+ channel/degenerin, NaC/DEG）家族(jiz)中的一員，其共同特點(diǎn)是均為非電壓門控的對Na+有高通透性的離子通道，且均可被Amiloride所阻斷。在證明了ASICs參與味覺2、觸覺3、痛覺4、及學(xué)習(xí)記憶5、精神功能的調(diào)節(jié)6等生理方面的功能之后，近幾年又在心絞痛7、炎癥8、視網(wǎng)膜變性9及缺血性腦損傷10等病理過程中，發(fā)現(xiàn)其具有一定的調(diào)節(jié)功能。但目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于ASICs參

11、與中樞氫離子濃度改變引起呼吸調(diào)節(jié)的相關(guān)報(bào)道。本文通過酸化人工腦脊液構(gòu)建家兔呼吸中樞興奮模型，選用ASICs的直接阻斷劑Amilorde與另一種未經(jīng)證實(shí)的間接阻斷劑MK-801，MK-801其作用機(jī)制可能通過阻斷ASICs上游興奮性氨基酸受體（NMDA受體），抑制ASICs蛋白的磷酸化。探尋ASICs參與呼吸中樞興奮的相關(guān)機(jī)制與途徑，同時尋找更為有效和特異性的通道阻斷劑，為臨床呼吸中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)障礙的診斷和治療提供理論依據(jù)。材料和方法藥品 20%烏拉坦，人工腦脊液（g/L）：NaCl 7.6，KCl 0.373，NaH2PO4 0.192，CaCl2 0.2886，MgSO4 0.23，NaHCO

12、3 2.18，葡萄糖 1.98，蔗糖 3.42，調(diào)pH至7.4，6.5，6.0，5.5，5.0，4.0配成酸化腦脊液，生理鹽水，Amiloride、MK-801、NMDA購自Sigma公司。動物制備 健康成年家兔8只，體重1.82.5kg，由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物部提供，烏拉坦（5mL/kg）耳緣靜脈麻醉，氣管插管，記錄II導(dǎo)聯(lián)心電和頸總動脈血壓。實(shí)驗(yàn)(shyn)動物(dngw)分組 共分為(fn wi)3個實(shí)驗(yàn)組。第1組為人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF）的pH梯度實(shí)驗(yàn)，n=6，家兔一側(cè)側(cè)腦室依次注射生理鹽水、pH值為7.4的正常腦脊液、pH值

13、分別為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0的酸化腦脊液。將空白、生理鹽水和正常腦脊液作為對照。第2組為ASICs直接阻斷劑Amiloride實(shí)驗(yàn)，n=3，Amiloride（1mmol/L與10mmol/L）與pH值為5.0的ACSF同時給藥，以pH值為5.0的ACSF作為對照。第3組為ASICs間接阻斷劑MK-801實(shí)驗(yàn)，其中A組（n=2）為MK-801（10mol/L與10mmol/L）與pH值為5.0的ACSF同時給藥，B組（n=2）為NMDA（10mmol/L與100mmol/L）與pH值為5.0的ACSF同時給藥，均以pH值為5.0的ACSF作為對照。側(cè)腦室給藥方法 使用腦

14、立體定位儀，根據(jù)Sawyer 圖譜值（P4 L/R5 H5）定位側(cè)腦室，使用不銹鋼外套管進(jìn)針，內(nèi)套管連接20L微量注射器給藥。每次注射20L，1min內(nèi)完成，留針1min。膈神經(jīng)放電記錄 動物取仰臥位，在頸外靜脈與頸內(nèi)靜脈角的深處找到臂叢神經(jīng)，分離跨過臂叢的膈神經(jīng)，并從俯臥位肩胛骨上緣重新找出，制作皮兜，掛上雙極銀絲電極記錄膈神經(jīng)的放電活動。神經(jīng)信號記錄使用SMUP-PC型生物信號處理系統(tǒng)，通過MFLab軟件記錄信號，并作信號后處理獲得呼吸頻率與膈神經(jīng)放電積分面積。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：呼吸頻率(RR)、膈神經(jīng)放電積分面積(PND)和心率(HR)。所有樣本以xSE表示，采用Microsoft

15、 Excel中t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P0.05）。與生理鹽水組的呼吸頻率（273bmp）相比，pH 6.0，5.5，5.0與4.0時呼吸頻率的改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01, P0.05），其值分別為429bmp，4312bmp，4411bmp與385bmp（圖2）。另外在相鄰組組間呼吸頻率的比較中發(fā)現(xiàn)pH 6.0與6.5兩組間的呼吸頻率有顯著差異（P0.05)（表1）。表 1 注射酸化人工腦脊液對家兔呼吸活動和心率的影響 Tab 1 Effects of microinjection of acidic ACSF on respiration and heart rate (n=6，xSE)

16、RR (bmp)PND (mV*s)HR (bmp)Control2942.392.3920955N.S.2732.322.5120760pH 7.42762.622.90211526.5 3242.182.05210516.0 429(2)2.212.23208485.5 4312(1)2.342.46205485.0 4411(2)2.492.40205504.0 385(2)2.442.2920149(1)P0.05, (2)P0.01 vs N.S.側(cè)腦室微量注射Amiloride對家兔呼吸(hx)活動和心率(xn l)的影響(yngxing) 家兔側(cè)腦室微量注射1mmol/L與10m

17、mol/L兩個濃度的Amiloride后，再注射pH 5.0的酸化人工腦脊液，家兔呼吸頻率分別為235bmp(n=3)與275bmp(n=3)，與pH 5.0的呼吸頻率415bmp(n=4)相比，有顯著性差異（P0.01, P0.05），（圖3）。10mmol/L濃度組膈神經(jīng)放電積分面積10.764.80mV*s(n=3)，與pH 5.0的放電積分面積2.453.51 mV*s (n=4)相比有顯著性差異（P0.05）（表2）。表 2 注射Amiloride對家兔呼吸活動和心率的影響 Tab 2 Effects of microinjection of Amiloride on respira

18、tion and heart rate (xSE)RR (bmp)PND (mV*s)HR (bmp)Control (n=4)3052.372.7622328N.S. (n=4)2742.533.0322127pH 5.0 (n=4)4152.453.5121940Amiloride(1mmol/L) 5.0 (n=3)235(2)2.943.1821237Amiloride(10mmol/L) 5.0 (n=3)275(1)10.764.80(1)22337(1)P0.05, (2)P0.05）。10mmol/L濃度的NMDA時呼吸頻率為4112bmp(n=2)，無顯著性差異（P0.05）

19、，100mmol/L濃度組的呼吸頻率加快到551bmp(n=2)，有顯著性差異(P0.05)，（圖4）。各組家兔膈神經(jīng)放電積分面積和心率與pH 5.0相比無顯著性差異（數(shù)據(jù)沒有列出）。討論在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家兔呼吸頻率的增加呈氫離子濃度依賴性，與生理鹽水對照組的呼吸頻率相比，pH下降到6.0時，發(fā)生明顯改變（P0.05），而于pH 5.0時達(dá)到峰值，pH 4.0時呼吸頻率的增加有所下降，呼吸頻率的改變在注射pH梯度人工腦脊液的過程中，呈反向U型劑量關(guān)系。這與之前有關(guān)組織pH值改變的相關(guān)研究結(jié)果大致相符，Kay Steen等11在對大鼠的痛覺傳入神經(jīng)與組織酸化的研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)放電在pH 6.1至5

20、.2之間與對照組相比平均增加2倍，而在pH5.2至pH4.3的范圍內(nèi)放電增加有所減弱。另外，Mette Hesselager等12通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測得的ASICs各亞型通道pH50在不同pH值上的分布情況為：pH 6.0 1a+1b，1b+3；pH 5.5 1a+2a；pH 5.0 1b+2a、1b+2a+3(4.9)、1a+2a+3(5.1)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示可能參與呼吸中樞興奮調(diào)節(jié)的ASICs亞型包括ASIC1或ASIC2。pH 5.0時家兔呼吸頻率達(dá)到峰值，提示呼吸中樞對氫離子的最適敏感值接近于pH5.0，有助于進(jìn)一步推測參與呼吸調(diào)節(jié)機(jī)制的具體ASICs通道的亞基組成。在觀察(gun

21、ch)到呼吸(hx)頻率的改變(gibin)與pH值呈反向U型劑量關(guān)系后，是否H+興奮呼吸活動的作用有ASICs的參與呢？根據(jù)ASICs均可被Amiloride所阻斷的公認(rèn)，如在離體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用Amiloride后，可以有效降低氫離子所引起的細(xì)胞膜電位的改變1, 13。本實(shí)驗(yàn)中中樞微量注射Amiloride后發(fā)現(xiàn)，家兔呼吸中樞對氫離子濃度改變的興奮性明顯下降，說明Amiloride在整體動物的層面上也具有降低機(jī)體中樞對氫離子濃度改變的敏感性的作用，同時提示ASICs可能參與氫離子引起呼吸中樞性興奮的過程。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Amiloride對呼吸頻率的改變作用并不呈濃度依賴，可能

22、是在低濃度組1mmol/L Amiloride時，對ASICs通道相應(yīng)位點(diǎn)的阻斷已達(dá)飽和。另外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用高濃度的Amiloride后，氫離子濃度改變所引起的膈神經(jīng)放電積分面積有所增加，與呼吸頻率的變化相反，提示可能Amiloride不同濃度的阻斷作用對呼吸神經(jīng)元起不同作用，引起呼吸中樞產(chǎn)生對呼吸頻率或呼吸幅度的不同調(diào)節(jié)，值得進(jìn)一步深入研究。在觀察到ASICs參與H+改變調(diào)節(jié)呼吸活動后，我們試圖分析ASICs參與過程中其上游的可能影響因素。已知MK-801可以阻斷NMDA受體的開放，從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（calmodulin-dependent protei

23、n kinase II, CaMK）的活性。Jun Gao等14在缺血所致神經(jīng)元損傷的大鼠模型中，利用免疫沉淀反應(yīng)（IP）的研究中發(fā)現(xiàn)，使用MK-801后，因缺血所致ASIC1a通道的磷酸化的比率有顯著降低。提示NMDA受體可能是ASICs上游，阻斷NMDA受體使對應(yīng)的特異ASICs通道因不能得到磷酸化而活性受到抑制。但是NMDA受體是否也參與ASICs對呼吸活動的調(diào)節(jié)呢？本實(shí)驗(yàn)中觀察到，與pH5.0相比，高濃度組100mmol/L NMDA引起呼吸頻率增加與pH 5.0時相比有明顯差異（P0.05），這可能是由于實(shí)驗(yàn)組樣本數(shù)太少所致。實(shí)驗(yàn)中興奮NMDA受體增加呼吸中樞對氫離子濃度改變的敏感性

24、，而抑制NMDA受體則減弱呼吸中樞對氫離子濃度改變的敏感性，提示NMDA受體與ASICs之間存在一定關(guān)聯(lián)（見圖5的模式圖）。側(cè)腦室注射(zhsh)酸化人工腦脊液、ASICs阻斷劑、NMDA受體激動劑與阻斷劑對家兔的呼吸活動產(chǎn)生影響(yngxing)，主要表現(xiàn)在呼吸頻率的改變(gibin)；而膈神經(jīng)的放電積分面積及對心率均無明顯影響。提示中樞ASICs的存在，以及ASICs主要參與H+改變對呼吸頻率的調(diào)節(jié)。動脈(dngmi)血液、組織液或腦脊液中的O2、CO2、H+的改變通過化學(xué)感受性反射來調(diào)節(jié)(tioji)呼吸活動。以往認(rèn)為這些化學(xué)因素的改變直接刺激中樞和外周化學(xué)感受器，引起呼吸中樞的興奮，現(xiàn)

25、在通過ASICs的發(fā)現(xiàn)(fxin)，證實(shí)了呼吸中樞對氫離子的敏感性還與ASICs有關(guān)，通過周圍局部氫離子濃度的改變影響ASICs的活性，進(jìn)而引起神經(jīng)元細(xì)胞膜電位的改變，從而產(chǎn)生對呼吸活動的調(diào)節(jié)。Amiloride作為目前常用的ASICs阻斷劑，并不具有相關(guān)通道亞型的特異性，開發(fā)ASICs特異的阻斷劑，可以為研究ASICs參與生理與病理生理功能提供必要的條件。而通過阻斷ASICs上游的NMDA-CaMKII磷酸化途徑，可能使特異的ASICs亞基的活性受到抑制，從而為探尋ASICs參與氫離子所引起的呼吸中樞興奮的調(diào)節(jié)機(jī)制提供更為有效的方法。參考文獻(xiàn)1 Waldmann R, Champigny G

26、, Bassilana F, et al. A proton-gated cation channel involved in acid-sensing J. Nature, 1997, 386(6621): 173-177.2 Ugawa S, Minami Y, Guo W, et al. Receptor that leaves a sour taste in the mouth J. Nature, 1998, 395(6702): 555-556.3 Price MP, Lewin GR, Mcllwrath SL, et al. The mammalian sodium chann

27、el BNC1 is required for normal touch sensation J. Nature, 2000, 407(6807): 1007-1011.4 Chen CC, Zimmer A, Sun WH, et al. A role for ASIC3 in the modulation of high-intensity pain stimuli J. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(13): 8992-8997.5 Wemmie JA, Chen J, Askwith CC, et al. The Acid-Activated Ion Cha

28、nnel ASIC Contributes to Synaptic Plasticity, Learning, and Memory J. Neuron, 2002, 34(3): 463-477.6 Wemmie JA, Coryell MW, Askwith CC, et al. Overexpression of acid-sensing ion channel 1a in transgenic mice increases acquired fear-related behavior J. Proc Natl Acad Sci, 2004, 101(10): 3621-3626.7 S

29、utherland SP, Benson CJ, Adelman JP, et al. From the Cover: Acid-sensing ion channel 3 matches the acid-gated current in cardiac ischemia-sensing neurons J. Proc Natl Acad Sci, 2001, 98(2): 711-716.8 Sluka KA., Price MP, Breese NM, et al. Chronic hyperalgesia induced by repeated acid injections in muscle is abolished by the loss of ASIC3, but not ASIC1 J. Pain, 2003, 106(3): 229-239.9 Ettaiche M, Guy N, Hofman P, et al. Acid-Sensing Ion Channel 2 Is Important for Retinal Function and Protects against Light-Induced Retinal Degeneration J. J Neurosci,