呼吸系統(tǒng)疾病Diseasesoftherespiratorysystem課件

1、免疫組化基本技術(shù) 倪 燦 榮第一部分 組織與細胞材料的制備內(nèi)容：組織與細胞材料 的取材和保存主要內(nèi)容一、人體組織標本的取材二、動物組織標本的取材三、取材注意事項四、細胞標本的準備五、組織的固定、脫水、透明和包埋六、切片七、組織與細胞材料的保存 概 述 免疫組織化學（Immunohistochemistry; IHC） 技術(shù)是一門綜合性技術(shù)，除了具備優(yōu)質(zhì)、高效，特異的一抗，敏感的檢測方法，穩(wěn)定的顯示系統(tǒng)外，還需要掌握組織標本或標本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的處理，內(nèi)源性酶的消除方法，非特異背景的消除方法，怎樣防止IHC染色過程中的脫片。 一、人體組織標本的取材 手術(shù)切除標本，各種活檢

2、穿刺標本和尸體解剖標本。1.手術(shù)切除標本的取材： 抗原在組織中的分布常不均一，取材時應(yīng)考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠離病灶的正常組織。組織大?。洪L1cm寬1cm厚0.20.3cm。2.各種小組織的活檢取材： 它不僅體積小，取材困難，不易取到主要病灶，因此對標本的處理應(yīng)特別慎重，及時固定，包埋時要平整。3.穿刺標本的取材： 光鏡（HE、特殊染色、IHC、ISH） 電鏡（透射電鏡、免疫電鏡）4.尸檢組織的取材 病人死亡后，一般要在數(shù)小時后才能做尸檢，因此，及時取材，盡早固定是開展IHC檢測的關(guān)鍵。二、動物組織標本的取材 動物的處死方式一般為活殺，組織標本來源較新鮮，10min內(nèi)即可完成固

3、定和冷凍保存，腦組織和神經(jīng)組織應(yīng)采用灌注固定后，再進行后固定。動物處死方法： 1.麻醉法 乙醚或4戊巴比妥靜注 2.空氣栓塞法 3.斷頭法 4.擊頭法 5.股動脈放血法三、組織取材注意事項 1.組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學工作。動物組織取材要求心臟還在跳動時取材。2.注意防止人為因素的影響 刀和剪要快，刀要足夠長。3.組織塊的大小 厚為0.10.3cm，大小可根據(jù)需要而定4.動物和人體組織的取材位置 要視研究目的，觀察部位而定5.取材時間 原則上，應(yīng)盡快取材，但比較大的手術(shù)標本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。 6.注意包埋方向 7.邊緣標記 8.保持材料的清

4、潔 9.切除不需要的部分10.明確編號，登記11.骨組織還需脫鈣四、細胞材料的準備 細胞的取材和制片法： 1.印片法：常用于活檢或手術(shù)切除標本。將新鮮標本沿病灶中心剖開，將病灶區(qū)輕壓于載玻片上，吹干后立即固定2030min。優(yōu)點：操作簡單，抗原保存好缺點：細胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。 2.穿刺吸取法 3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、腦脊液等體液多而細胞較少的標本。 （1）常規(guī)細胞玻片制片法 （2）單核細胞分離法3.制備細胞玻片應(yīng)注意 （1）易脫片； （2）細胞應(yīng)集中在直徑0.61.0cm的圓圈內(nèi)，總數(shù)105-106； （3）富于粘液的標本，未經(jīng)處理不宜做IHC。4.活細胞標

5、本的制備法 培養(yǎng)的活細胞可分貼壁和懸浮二種。貼壁細胞可將 （1）細胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。 （2）將細胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。 （3）將細胞直接培養(yǎng)在6孔或9孔板上，經(jīng)固定后可行IHC。五、組織標本的固定 1.目的 (1)防止組織細胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細胞的固有形態(tài)。 (2)使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起 來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學 上的差異，以便染色后易于鑒別和 觀察。（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、 增

6、加組織硬度、便于制片。（5）防止細胞過度收縮或膨脹而失 去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。（6）經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生 不同的親和力而著色清晰，便 于辨認。2.固定液的種類 (1)甲醛固定液 10福爾馬林 10中性福爾馬林 10中性緩沖福爾馬林(2)4多聚甲醛固定液(3)Bouin S液及改良Bouin S液(4)Zenker S液 重鉻酸鉀 25mg 氯化汞 10g 冰醋酸 50ml 蒸餾水 800ml(5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 飽和苦味酸 150ml PB液至 1000ml(6)PLP固定液：過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑較適合于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保

7、存較好。(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重鉻酸鉀25ml。(8)Kanovsky S液(9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4保存?zhèn)?用，對核內(nèi)抗原的保存效果較好。(10)PEG液(11)0.4%對苯醌(12)碳二亞酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇類固定劑 丙酮、乙醇 類固定劑其固定原理主要是對蛋白 質(zhì)的沉淀而發(fā)生固定作用。3.固定方法的選擇及注意事項 (1)大小 2cm2cm0.3cm (2)及時固定(3)固定時間 固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固

8、定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。(4)組織固定后必須徹底沖洗。六、組織脫水、浸蠟及包埋 1.目的 由于石蠟不溶于水和醇類試劑，只溶解在二甲苯類試劑中。因而,組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分,需用乙醇類試劑進行脫水,水脫完后,組織內(nèi)含有大量的乙醇,還必須用能溶解乙醇的二甲苯來置換,最后經(jīng)浸蠟,組織細胞內(nèi)被大量石蠟支稱,才使組織能用于石蠟切片。2.脫水劑的種類：非石蠟溶劑的脫水劑和脫水兼石蠟溶劑的脫水劑。 常用的脫水劑:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)環(huán)乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陸環(huán)。3.常用的透明劑：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯

9、；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油4.原則 脫水方法甚多，一般需逐級進行脫水，否則可引起組織強烈收縮，組織變形。 在脫水完全的前提下，組織的透明必須徹底，但不能過長，否則會引起組織切片困難。5.常規(guī)石蠟包埋過程(1)脫水：75、85乙醇，95、 乙醇，無水乙醇、。(2)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯(3)浸蠟：石蠟、石蠟、石蠟(4)石蠟包埋：修蠟塊，標號6.根據(jù)本實驗室經(jīng)驗各種不同類型組織 的石蠟包埋條件(1)大動物組織（狗、兔、小兒尸檢）脫水、透明和浸蠟時間 75乙醇30120min，85乙醇30120min，95乙醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇過夜，無水乙醇3060min，無水乙醇

10、3060min，無水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可視觀察結(jié)果而定），石蠟30min，石蠟12h，石蠟23h。(2)小動物組織脫水、透明和浸蠟時間 75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h，1h，過夜或2h，無水乙醇、和各30min，二甲苯15min, 10min，10min（肉眼觀察），石蠟30min，石蠟30min，石蠟12h。(3)活檢或手術(shù)切除標本的脫水透明和浸 蠟時間 75乙醇30min，85乙醇1h，95乙醇1h，1h和4h或過夜，無水乙醇30min，12h和4h，二甲苯30min，30min和1h。七、組織切片 切片可分石蠟切片、冰凍切片、火棉膠

11、切片，IHC切片要求不同與常規(guī)切片，需連續(xù)有序，防止脫片等特殊要求。1.切片前的準備工作(1)載玻片的清潔：市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開展原位雜交，還需將玻片240烤2h。(2)切片粘合劑的種類 多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。 APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干凈載玻片丙酮5min APES（1ml+50ml丙酮）：用鑷子夾住浸入APES試劑13次純丙酮洗二次干燥玻片用鋁箔包好，室溫或4保存?zhèn)溆?。鉻礬明膠液： 鉻礬0.5g 明膠5g H2O2 1000ml甲醛明膠液： 40甲醛2.5ml 明膠0.5g H2O2 100ml2.

12、石蠟切片：3.冰凍切片：IHC冰凍切片，ISH冰凍切片 (恒冷箱冰凍切片機和開放式冰凍切片機)4.切片要求及注意事項： (1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)編上號 (6)切片可在4保存數(shù)年（石蠟切片）(7)冰凍切片后需涼干后立即固定(8)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組 織需經(jīng)庶糖處理24h，冰凍切片。(9)冰凍切片固定后-80保存?zhèn)溆冒?、組織與細胞材料的保存 1.冷凍保存： -80，-145，-198 組織應(yīng)在離體30min內(nèi)，快速取材，放入專用冷凍管中，并編上號，登記在冊。2.新鮮組織經(jīng)適當固定后，裝入凍存管 中

13、，-80凍存。3.蠟塊的保存4.活細胞的保存 可根據(jù)需要將細胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上，9孔板上的細胞可經(jīng)固定后-80保存?zhèn)溆茫笕萘颗囵B(yǎng)的細胞收集凍存在液氮中。第二部分 IHC的一些基本技術(shù)主要內(nèi)容一、實驗的設(shè)計二、石蠟切片的脫蠟至水三、內(nèi)源性酶的消除方法四、IHC的非特異性染色五、抗原的暴露和修復(fù)六、抗體的購置及注意事項七、抗體最佳稀釋度的測定和保存 八、顯示系統(tǒng)及襯染劑的選擇和配制 九、IHC常用緩沖液一、實驗的設(shè)計 1.查閱相關(guān)文獻，列出要做的IHC指標，根據(jù)經(jīng)費情況，選擇相關(guān)公司購置特異性抗體和檢測試劑。2.列出IHC實驗操作流程，選擇何種IHC前 處理方式。3.通過預(yù)實驗尋找第一抗體的最

14、佳稀釋度， 應(yīng)設(shè)置何種對照。4.每批實驗應(yīng)用同一稀釋度的一抗，孵育 時間和溫度，同一的顯色時間。5.列出陽性判定的標準6.預(yù)期達到的目標二、石蠟切片脫蠟至水 冰凍切片從-80取出，涼干或電吹風吹干后可直接進行免疫組化標記。石蠟切片需經(jīng)如下脫蠟才能做IHC。 二甲苯10min，二甲苯10min，二甲苯10min，無水乙醇2min，95乙醇2min，85乙醇2min，75乙醇2min，流水沖洗。三、內(nèi)源性酶的消除方法(一)內(nèi)源性過氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%3%H2O2甲醇液20min 2. 1 H2O2 20min 3. 3苯肼溶液 37 1h 4. 0.075%鹽酸甲醇液 30min5

15、.DAB-H2O2溶液中加0.005M NaN3過碘酸-硼酸鈉：0.5%過碘酸10min， 經(jīng)洗后1硼酸鈉處理10min。7.20mol/L-100mol/L抗壞血酸3060min。(二)內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除方法 1. 10醋酸 10min 2. 0.5mol/L碳酸氫鈉（pH9.0） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min(三)內(nèi)源性生物素的消除方法 1.用2-甲基-D苷露糖飽和生物素 2.先用25g/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素飽和液中處理15min，PBS洗15min。四、IHC的非特異性染色 1.特異性抗體不純 2.抗體免疫球蛋白所帶電荷與檢測

16、組織所帶電荷差異很大，可引起非特異染色。 3.IgG的交叉反應(yīng)4.共同抗原決定簇5.單一決定簇抗體的異質(zhì)性6.特異性抗原彌散7.IgG受體干擾8.鼠源性抗體檢測鼠源性組織解決方法： 1.用正常二抗血清吸附 2.將組織用酶消化或抗原修復(fù) 3.二抗用木瓜酶將抗體結(jié)合部Fab切除 4.高度稀釋特異性一抗五、酶消化和抗原修復(fù) 1.為什么要進行酶消化和抗原修復(fù)？(1)固定液的影響 自1893年Ferdinand Blum創(chuàng)立組織固定以來，為了避免組織固定液對抗原決定簇的影響，已經(jīng)尋找到幾十種固定液，目的就是為了對一定抗原起到保護作用，同時還能獲得良好的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。目前無一種固定液適用于所有的抗原，從組

17、織細微結(jié)構(gòu)的保存，穩(wěn)定、簡便和廉價綜合評估上，甲醛最優(yōu)。 甲醛使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固，自身和之間會發(fā)生交聯(lián)，交聯(lián)時會使蛋白質(zhì)的四級和三級結(jié)構(gòu)的折疊方向發(fā)生改變，使蛋白質(zhì)苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的抗原決定簇發(fā)生改變，而影響檢測。(2)抗體制備的影響2.酶消化 (1)原理： 1)去除覆蓋于抗原決定簇表面的雜蛋白 2)斷交聯(lián)(2)蛋白酶的種類 胰蛋白酶0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化鈣，用0.1N NaoH調(diào)pH至7.8。消化時間37 30min。胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀釋，消化時間37 30180min。蛋白酶K 20g/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化時間37

18、2040min。鏈酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀釋，消化時間37 14h。無花果蛋白酶 0.1%濃度，用0.2M pH7.4 PBS稀釋，消化時間37 3060min。菠蘿蛋白酶 其濃度為0.4%1，溶在0.01M，pH7.4 PBS中，37消化30120min。尿素 濃度3M 37 530min(3)原則及注意事項 胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測前消化，其余蛋白酶均為細胞內(nèi)抗原的顯示消化。 在配制和使用時應(yīng)考慮到酶激活的最佳pH值，消化溫度、濃度和孵育時間。3.熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)：抗原修復(fù)(Antigen Retrieval;AR)是以高溫、高

19、壓對常規(guī)固定的石蠟切片進行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術(shù)手段。(1)依據(jù)：40年代美國學者Fraenkel-conrat等實驗證實，甲醛和蛋白水解交聯(lián)過程中氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(抗原決定簇)如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過120高溫或強堿處理后，可使交聯(lián)打開。(2)修復(fù)方式：微波9610min2；直接加溫100，15min；水浴鍋100，15min；高壓鍋/消毒鍋120，5min；真空加熱10min；直接烤片法。(3)修復(fù)介質(zhì)： 0.01M pH6.0檸檬酸緩沖液(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-12系列);0.01M pH7.0 PBS;

20、2%硫酸鋁；2硝酸鋁；生理鹽水；蒸餾水。認為修復(fù)介質(zhì)種類和溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果影響較小，而pH值則影響較大。緩沖液以CB和Tris-HCL較常見。(4)溫度與修復(fù)時間的關(guān)系：許多的實驗結(jié)果表明，溫度高修復(fù)時間短，呈正相關(guān)。例如，Ki-67、P-gp的檢測，利用同一切片，達到相同的染色結(jié)果如下步驟：100 20min；90 40min；80 60min；70 20h。(5)選擇最佳的修復(fù)方法根據(jù)下表選擇最佳的修復(fù)方法檸檬酸Buffer pH1-2 Ph6 Ph10-11Tris-HCL Buffer pH1-2 Ph7-8 Ph10-11微波100 10min2 切片1 切片2 切片3壓力鍋

21、120 10min 切片4 切片5 切片6微波或水浴鍋90 30min 切片7 切片8 切片9 切片10作陽性對照，不作任何處理(6)AR應(yīng)注意的問題：高溫AR因其機理尚不清楚，對某些存在的問題或現(xiàn)象不可能用設(shè)計對照的方法加以解決或解釋清楚，例如，有些抗體在冰凍切片上不表達，或表達率很低，但石蠟切片用AR后，卻能很好地表達；某些應(yīng)表達在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)過量修復(fù)后，絕大部分表達在核內(nèi)；某些應(yīng)表達在核內(nèi)的抗原，經(jīng)過量修復(fù)后出現(xiàn)在細胞漿內(nèi)。因此對結(jié)果的判斷要作出客觀的分析。在操作過程中還應(yīng)注意如下問題：熱處理后應(yīng)注意自然冷卻；熱處理液不要讓其煮干；不要任何抗原的檢測都使用該方法；一批抗原的檢測其

22、溫度和時間一定保 持一致；形態(tài)學結(jié)構(gòu)的改變：一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，而對細胞核內(nèi)影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象。如果在常用的修復(fù)液無法得到陽性結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用某些不常用的修復(fù)液，或加一些螯合劑，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修復(fù)。六、抗體的購置及注意事項 1.抗體的購置 目前商品化抗體已有上千種，一種抗體可以有數(shù)家公司生產(chǎn)，其質(zhì)量的好壞也存在很大差異，首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司，根據(jù)文獻提供的信息，選擇所需試劑的型號。2.購置抗體的注意事項 (1)種屬：單克隆抗體，多克隆抗體 (2)能否用于石蠟切片 (3)稀釋度 (4)特異性，交叉反應(yīng) (5

23、)用何種組織前處理形式 (6)包裝單位，價格3.抗體的大致分類 (1)癌基因與抗癌基因標記物； (2)細胞凋亡標記物； (3)各種信號傳導(dǎo)標記物 (4)各種正負調(diào)控基因標記物 (5)細胞增殖及調(diào)控標記物； (6)凝集素類標記物 (7)激素受體標記物 (8)病毒性標記物 (9)各類腫瘤標記物 (10)耐藥基因標記物七、抗體最佳稀釋度的測定和保存 1.直接測定法一抗稀釋度 特異性染色 非特異性染色 1:50 + + 1:100 + + 1:200 + + 1:400 + + 1:500 + () 陰性對照 () ()2.棋盤法3.抗體稀釋液 抗體稀釋液是從事IHC工作實驗室必備，其制備方法如下：1

24、克明膠(紅、綠)溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS中，加溫，攪拌使其溶解，待其冷卻后，加入1克牛血清白蛋白和100mg NaN3，4保存。4.抗體的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐劑，在4中保存一年其質(zhì)量不會有太多的改變，如一次購置量大，可10l/支分裝，標上號，-40保存?zhèn)溆?。用抗體稀釋液稀釋一抗可在4中保存一年。 八、顯示系統(tǒng)及襯染劑的選擇和配制 (一)顯示系統(tǒng) 目前用于IHC的標記酶主要有HRP，AKP，其顯示系統(tǒng)分別為：1.HRP常用的發(fā)色基因： (1)3、3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3、3-diaminbezidine;DAB); (2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);(3)四甲基聯(lián)苯胺；(4)鹽酸對苯二胺；(5)4