小檗誘導(dǎo)人白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的實驗研究

1、小檗誘導(dǎo)人白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的實行研究【摘要】目的研究小檗胺誘導(dǎo)人白血病jurkat細(xì)胞凋亡的機制。要領(lǐng)tt法測人白血病jurkat細(xì)胞i50值及細(xì)胞毒作用，hehst33258熒光染色法不雅察小檗胺凋亡小體形成，流式細(xì)胞儀annexin-fit-pi法檢測細(xì)胞凋亡產(chǎn)生率，pi染色法檢測凋亡峰及細(xì)胞周期，同時流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞aspase-3卵白表達。效果小檗胺能選擇性按捺人白血病jurkat細(xì)胞生長且呈濃度依靠干系，作用48hjurkat細(xì)胞i50值為6.60.5g/l；小檗胺能誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停滯于s期；同時細(xì)胞aspase-3卵白表達增高。結(jié)論小檗胺能激活as

2、pase-3卵白表達，誘導(dǎo)人白血病jurkat細(xì)胞凋亡且呈時效干系?！娟P(guān)鍵詞】jurkat細(xì)胞experientalstudyfberbaineinduingapptsisinhuanleukeiajurkatellshuangzhi-yu1,dngqing-hua2(1.zhejianganerhspital,hangzhu310022,hina;2.anerinstitutefzhejianguniversity,hangzhu310009,hina)keyrds:berbaine;jurkatells;apptsis;aspase-3小檗胺是一種雙芐基異喹啉生物堿類化合物，具有抗氧化、免

3、疫按捺、升高白細(xì)胞等多種臨床作用1。比來的研究表白，小檗胺能調(diào)治細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度2,3，下調(diào)多藥耐藥基因表達以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥4，有少量研究表現(xiàn)其對腫瘤細(xì)胞的增殖按捺作用5,6，但其作用機制仍不甚明晰。本實行不雅察小檗胺對人白血病jurkat細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，并對其作用機制舉行探究。1質(zhì)料與要領(lǐng)11藥品與試劑tt、碘化丙啶pi、小檗胺、hehst33258為siga公司產(chǎn)物，rpi1640造就基為美國hylne公司產(chǎn)物，annexin-fit-pi試劑為iunteh公司產(chǎn)物，ytfix/ytper、aspase3-pe及鼠igg1-fit/pe同型陰性比較為美國pharingen公司產(chǎn)物。12實行

4、質(zhì)料和重要儀器細(xì)胞造就瓶及造就板為丹麥nunln公司產(chǎn)物；超凈事情臺及2造就箱為德國heraeus產(chǎn)物；alla酶標(biāo)儀為芬蘭產(chǎn)物；fasan流式細(xì)胞儀為美國bd公司產(chǎn)物；axiskp2熒光顯微鏡為zeiss公司產(chǎn)物。13細(xì)胞系及造就jurkat細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物所，10%小牛血清，5%2，37孵箱中通例造就。14tt法測jurkat細(xì)胞的i50值及生長按捺曲線取對數(shù)生恒久細(xì)胞接種于96孔造就板內(nèi)，6復(fù)孔。每孔104個/l細(xì)胞，參加差異濃度的小檗胺，總體積200l，造就48h后，每孔參加1g/ltt事情液50l，37安排4h，離心2000r/in，5in，棄上清，每孔參加150lds，震蕩溶解

5、結(jié)晶，在波長570n比色，求出半數(shù)按捺濃度i50及生長按捺曲線。正常比較接納康健人外周血fil分散液分散的單個核血細(xì)胞。15細(xì)胞凋亡檢測jurkat細(xì)胞經(jīng)藥物差異處置懲罰后，取110/l細(xì)胞懸液1l用磷酸鹽緩沖液洗2次后，參加緩沖液490l、annexin-5l和碘化丙錠pi5l，暗處冰上反響10in，上機檢測，ellquest軟件闡發(fā)。另取2106細(xì)胞，70%冰乙醇結(jié)實，24h后pbs洗2次，參加1g/lrnasea200l，37水浴30in，再加pi染色液避光反響30in，上機檢測10000個細(xì)胞，ultiyle軟件闡發(fā)亞二倍體峰及細(xì)胞周期。16hehst33258染色不雅察細(xì)胞凋亡形態(tài)用

6、1g/lhehst332581l孵育100l細(xì)胞810/l10in，樣品作細(xì)胞甩片，氣氛枯燥后加蓋玻片，zeiss熒光顯微鏡不雅察，d照相。17aspase-3表達流式檢測取2106細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗2次，細(xì)胞結(jié)實及破膜、熒光抗體染色按試劑說明操縱，同時用鼠igg1-fit/pe設(shè)立陰性同型比較。上機檢測。ellquest軟件闡發(fā)。18統(tǒng)計學(xué)處置懲罰本實行中全部數(shù)據(jù)均接納xs表現(xiàn)，組間闡發(fā)接納t查驗。2效果21小檗胺細(xì)胞毒作用小檗胺能顯著按捺jurkat細(xì)胞生長，且有濃度依靠干系。隨著藥物作用濃度從0.5g/l增長到10g/l，細(xì)胞存活率由93.69%低落為14.85%，在此作用濃度范疇內(nèi)小

7、檗胺對正凡人外周血白細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒作用圖1。小檗胺作用48h，jurkat細(xì)胞i50值為6.60.5g/l。22小檗胺誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞凋亡用熒光顯微術(shù)不雅察正常jurkat細(xì)胞，可見細(xì)胞核為圓形，染色勻稱。在用5g/l小檗胺處置懲罰48h后，部門細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集及邊沿化，出現(xiàn)凋亡小體圖2。用annexin-/pi雙染色法定量檢測表白，正常jurkat細(xì)胞自覺凋亡率低，約3.4%。5g/l小檗胺作用12h后，jurkat細(xì)胞質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸ps外翻增多，細(xì)胞凋亡率增長為5.97%，24h細(xì)胞凋亡率為20.5%，48h細(xì)胞凋亡率增長為44.72%圖3。24h細(xì)胞凋亡率與48h比

8、力，差異有極明顯性p0.01。23小檗胺對jurkat細(xì)胞周期的影響jurkat細(xì)胞經(jīng)5g/l小檗胺小檗胺處置懲罰48h后，出現(xiàn)凋亡峰亞g1期，峰值為28.5%，同時細(xì)胞周期產(chǎn)生變革，g0/g1期細(xì)胞百分率由未經(jīng)藥物處置懲罰時的53.8%低落為35.7%，s期細(xì)胞百分率顯著由未經(jīng)藥物處置懲罰時的41.0%增長到59.5%，g2/期細(xì)胞百分率變革不大，別離為5.2%和4.8%。24aspase-3卵白表達變革未經(jīng)藥物處置懲罰的jurkat細(xì)胞aspase-3卵白表達率為1.62%，經(jīng)5g/l小檗胺作用12h后aspase-3卵白表達略有增長，為2.23%；作用24h后aspase-3卵白表達率為

9、9.83%，作用48h后aspase-3卵白表達率為20.9%。3討論如今以為，腫瘤的產(chǎn)生和細(xì)胞增殖與凋亡平衡失調(diào)有關(guān)7。細(xì)胞凋亡在腫瘤生長歷程中起負(fù)調(diào)控作用，可以停頓腫瘤敏捷生長。人們在腫瘤治療的恒久理論中，漸漸熟悉到可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來到達治療腫瘤的目的。小檗胺于1980年擺布作為一種升高白細(xì)胞的藥物而受到研究，早期研究重要會合在對機體免疫成效的影響及其臨床療效上1，厥后研究創(chuàng)造小檗胺具有抗腫瘤、抗氧化作用47，是一種鈣調(diào)卵白拮抗劑2,3。小檗胺抗腫瘤作用重要表如今按捺腫瘤細(xì)胞增殖，并且此方面的研究很少5,6。徐榮臻等研究創(chuàng)造小檗胺能低落k562細(xì)胞br/abl交融基因表達，誘導(dǎo)k5

10、62細(xì)胞凋亡。本研究表白，jurkat細(xì)胞經(jīng)小檗胺作用后，能以劑量依靠干系使細(xì)胞增殖受按捺，并且細(xì)胞能形成凋亡小體和凋亡峰、細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸外翻annexin-+細(xì)胞，表白小檗胺抗細(xì)胞增殖作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的，這種作用具有顯著的時效干系。與此同時，雷同濃度小檗胺對正凡人造血細(xì)胞無顯著毒性作用。很多抗腫瘤藥物能使腫瘤細(xì)胞周期停滯于某一時期，從而按捺腫瘤細(xì)胞增殖8。我們的研究創(chuàng)造，小檗胺作用后jurkat細(xì)胞g2/期比例顯著低落，s期細(xì)胞增高，表白小檗胺對jurkat細(xì)胞增殖按捺作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖停滯于s期。aspase酶系在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵緊張作用，在促凋亡信號的作用

11、下，一系列卵白，如細(xì)胞色素等可與aspase酶系結(jié)合，啟動aspase級聯(lián)反響，終極導(dǎo)致細(xì)胞凋亡9。研究表白隨著小檗胺作用濃度增長，活化aspase-3卵白表達增長，提示小檗胺能激活aspase酶系來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。小檗胺對正凡人淋巴細(xì)胞沒有顯著毒性，但能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，大概是一種有前程的治療白血病的藥物，值得進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1羅崇念,林新,王立為,等.小檗胺對小鼠脾細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞活性的按捺j.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1995,92：159-160.2李柏巖,付兵,趙艷玲,等.小檗胺對造就的hela細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的作用j.中國藥理學(xué)報,1999,2011:1011-1014.3

12、李柏巖,喬國芬,趙艷玲,等.小檗胺對atp誘導(dǎo)的造就平滑肌及心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣發(fā)動的影響j.中國藥理學(xué)報,1999,208:705-708.4董慶華,鄭樹,徐榮臻,等.小檗胺對多藥耐藥k562/adr細(xì)胞作用的研究j.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2022,249:820-822.5xur,dngq,yuy,etal.berbaine:anvelinhibitrfbr/ablfusingeneithptentanti-leukeiaativityj.leukres,2022,30(1):17-23.6anggy,zhangj,luqh,etal.berbaineinduesapptsisinhuanhepataelllines7721bylssinithndrialtransebraneptentiala