醫(yī)學專題檢測CD4CD8T淋巴細胞的意義續(xù)

1、CD4T淋巴細胞檢測標準及要求毛愛玲山西省性病艾滋病監(jiān)測中心12021/7/19 星期一22021/7/19 星期一HIV在人體內的復制1.吸附及穿入：gp120+CCR5 GP41和膜融合核衣殼穿入宿主細胞2.脫衣殼和逆轉錄：P24+親環(huán)素出殼RNA依賴的DNA聚合酶逆轉錄cDNA3.環(huán)化：cDNA 雙鏈環(huán)狀DNA 4.整合：雙股DNA整合入宿主細胞染色體DNA中前病毒5.轉錄：前病毒DNA RNA mRNA 6.翻譯與裝配：Gag蛋白與病毒的RNA結合裝配成核殼體。7.病毒成熟、出芽：芽生方式釋放32021/7/19 星期一42021/7/19 星期一AIDS發(fā)病機理 HIV侵入人體后主要

2、攻擊的是一種帶CD4抗原的淋巴細胞（T4淋巴細胞）。這種細胞是免疫系統(tǒng)的基本組成部分，HIV通過大量、不斷地復制與釋放，導致T4淋巴細胞進行性下降，感染者免疫功能遭到嚴重破壞，造成免疫缺陷。臨床表現(xiàn)為各種各樣機會性感染與腫瘤。52021/7/19 星期一AIDS發(fā)病機理HIV進入人體后能選擇性地侵犯有CD4受體的淋巴細胞，當病毒顆粒釋放出來后，繼續(xù)攻擊其他CD4T淋巴細胞。大量的CD4+T淋巴細胞被HIV攻擊后，首先引起細胞功能的障礙。HIV病毒在細胞內大量繁殖，導致細胞的溶解和破裂。62021/7/19 星期一AIDS發(fā)病機理3. HIV在細胞內復制后，以芽生方式釋出時可引起細胞膜的損傷。由

3、于HIV可抑制細胞膜磷脂的合成從而影響細胞膜的功能，導致細胞病變。4. HIV還可以感染骨髓干細胞導致CD4+T淋巴細胞減少。72021/7/19 星期一AIDS發(fā)病機理5. 當受HIV感染的CD4+T淋巴細胞表面存在的gp120發(fā)生表達后，它可以與未感染的CD4+T淋巴細胞CD4分子結合，形成融合細胞，從而改變細胞膜的通透性，引起細胞的溶解和破壞。6. 游離的gp120也可以與未感染的CD4+T淋巴細胞結合，作為抗體介導依賴性細胞毒作用的抗原，使CD4+T淋巴細胞成為靶細胞，受K細胞攻擊而損傷。 82021/7/19 星期一AIDS發(fā)病機理 HIV感染后一般首先出現(xiàn)CD4T淋巴細胞輕度至中度

4、降低，該細胞總數(shù)可持續(xù)數(shù)年不變，反應病毒為免疫應答所抑制。歷經一段時間后， CD4+T細胞逐漸進行性下降，表明病毒逐漸逃脫了免疫應答的控制。當CD4+T淋巴細胞一旦下降至200細胞/l或更低時，則就可出現(xiàn)機會性感染。92021/7/19 星期一HIV感染的三種結局典型進展者：8-10年內免疫功能逐漸下降，最后發(fā)展成為艾滋病?？焖龠M展者：CD4+細胞計數(shù)在2-5年內迅速下降，抗HIV抗體水平很低，HIV感染后有較高的病毒載量。長期存活者（長期不進展者）：感染后維持健康狀態(tài)12年以上，且CD4+計數(shù)維持正常。102021/7/19 星期一 HIVinfectionJ. Coffin, XI Int

5、ernational Conf. on AIDS, Vancouver, 1996艾滋病的病程就象一列迫近懸崖的火車病毒載量 = 火車的速度 CD4 計數(shù) = 離懸崖的距離112021/7/19 星期一122021/7/19 星期一從 HIV感染發(fā)展到艾滋病 HIV一旦進入人體，這個人就成為HIV感染者。經過急性感染期潛伏期，以后逐漸發(fā)展成艾滋病病人。處于潛伏期的感染者免疫功能沒有受到嚴重破壞，因而沒有明顯的臨床癥狀。從感染者到艾滋病病人這段潛伏期時間的長短與感染途徑感染病毒的數(shù)量感染者的年齡、生活條件、心理、生理狀況等多種因素有關，短則幾年，長則20年。發(fā)達國家較長，發(fā)展中國家短些。資料表明

6、，經輸血傳播的潛伏期較短，經性接觸傳播的潛伏期較長。132021/7/19 星期一檢測CD4、CD8T淋巴細胞的意義淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)內功能最重要的一群細胞，在正常機體內各淋巴細胞亞群相互作用，維持機體正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導致機體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列病理變化。因此，T淋巴細胞亞群的免疫分型能夠提供有關患者免疫狀態(tài)的重要信息。AIDS是由HIV引起的一組綜合癥，HIV主要侵犯人CD4T淋巴細胞，導致其數(shù)量上的減少和功能缺陷，使機體免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最終導致各種機會感染和腫瘤142021/7/19 星期一檢測CD4、CD8T淋巴細胞的意義

7、(續(xù))CD4T淋巴細胞絕對值的檢測在HIV感染和艾滋病病人治療以及病毒治療療效方面發(fā)揮了重要的作用1.了解機體的免役狀態(tài)以確定疾病分期2.監(jiān)測疾病進程3.評估疾病預后4.制定抗病毒治療及機會性感染預防性治療方案評估抗病毒藥物療效152021/7/19 星期一檢測CD4、CD8T淋巴細胞的意義(續(xù))因而，對HIV感染者和AIDS病人定期進行CD4、CD8T淋巴細胞檢測具有十分重要的意義。美國疾病預防控制中心就是以此為基礎制訂了HIV感染者/AIDS病人的診斷和分類標準，目前國內外仍被采納應用。162021/7/19 星期一規(guī)范的AIDS治療 目前我國HIV治療范圍逐漸擴大，國家示范區(qū)大批的治療已

8、經開始。我省也于2004年啟動了對AIDS的治療。但是由于檢測費用昂貴，大批治療中50%以上病人不進行規(guī)范檢測.一旦出現(xiàn)耐藥病人，后果將不堪設想。所以規(guī)范的實驗室檢測是非常重要的一個環(huán)節(jié)。172021/7/19 星期一實 驗 室 條 件 1.人員 進行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴細胞檢測的人員須具有艾滋病實驗室的上崗資格，并接受過省級以上艾滋病實驗室安全及實驗操作技術培訓。182021/7/19 星期一實 驗 室 條 件(續(xù)) 設施和設備樣品處理區(qū)：生物安全柜、離心機、冰箱、水浴箱、旋轉震蕩器、精確移液器（5ul50u1、20u1200u1、 200u11000u1)。 流式細胞

9、儀檢測區(qū)：流式細胞儀192021/7/19 星期一實 驗 室 條 件(續(xù)) 功能分區(qū) 實驗室應分為樣品處理區(qū)和流式細胞儀檢測區(qū)，各區(qū)的功能是： 樣品處理區(qū)應達到生物安全級實驗室要求，用于樣品處理、流式檢測樣品制備。流式細胞儀檢測區(qū)用于制備好的樣品上機檢測。202021/7/19 星期一方 法目前用于CD4和CD8T淋巴細胞計數(shù)的檢測方法分為自動檢測方法和手工操作法。自動檢測方法包括流式細胞儀（主要有多平臺三級程序法和單平臺一步法）和專門的細胞計數(shù)儀。手工操作法包括幾種手工操縱試驗，需要顯微鏡或酶聯(lián)免疫試驗設備。212021/7/19 星期一方 法檢測CD4T淋巴細胞數(shù)的標準方法為流式細胞儀，可

10、得出CD4,CD8等淋巴細胞及比值。為確保檢測的準確性，應建立內部質量控制及參加國家室間評價。222021/7/19 星期一流式細胞儀 (FACS Calibur, BD)232021/7/19 星期一簡易流式細胞儀器（FACSCount, BD)242021/7/19 星期一免疫指標的檢測 CD4/CD3 CD8/CD3 CD3 CD4/CD8252021/7/19 星期一全省CD4流氏細胞儀分布山西省艾滋病確證中心實驗室運城市艾滋病確證實驗室臨汾市艾滋病確證實驗室太原市艾滋病確證實驗室大同市艾滋病確證實驗室長治市艾滋病初篩中心實驗室262021/7/19 星期一CD4細胞樣本采集運送檢測要

11、求272021/7/19 星期一1.成功的臨床治療效果評定依賴于有保障的標本采集、保存、檢測，以及數(shù)據處理等等。在研究前期就要有計劃的設計研究項目，確定所需要的標本類型。比如：所有的血液標本是否需要抗凝處理、是否需要無菌等 標 本 采 集 的 要 求282021/7/19 星期一標本采集的要求(續(xù))2.采集的標本應該長期保存，至少要求保存至此項目完成。血液標本可用于CD4T淋巴細胞 、抗原、抗體檢測，病毒分離，PCR檢測.3.血液標本應盡量在24小時內處理，尤其是CD4T淋巴細胞檢測、病毒分離，PCR檢測.292021/7/19 星期一標 本 的 采 集(續(xù)) 選擇合適的抗凝劑，分別用于血液學

12、檢測和流式細胞儀的免疫表型檢測。 用于血液學檢測的抗凝劑 K3EDTA （1.50.15mg/ml血液)。 枸櫞酸鈉 (3)肝素 在血球分析儀生產商允許的時間范圍內檢測，不超過30h，不檢測超出抗凝時間范圍的樣品。 用于流式細胞儀的抗凝劑主要是K3EDTA 302021/7/19 星期一標本的采集312021/7/19 星期一 標 本 的 采 集采集用品采血管 真空、負壓 抗凝（EDTA或枸櫞酸鈉） 無菌針頭 蝶形針頭322021/7/19 星期一采集用品：采血套管固定采血管位置，方便操作；保護操作者的安全注意：切勿將采血針頭的套管回套！注意采血后器具的放置、消毒、處理 標 本 的 采 集(續(xù)

13、)332021/7/19 星期一標本的采集(續(xù)) 采血后應立即握住試管兩端，顛倒混勻多次，將血液與抗凝劑混勻，以防止凝固。 準備適當數(shù)量的樣品管當同一樣品的血球檢測和流式細胞儀免疫表型檢測在同一實驗室內進行時，用一個裝有K3EDTA的試管即可。對所有樣品編號，并寫明日期和時間。342021/7/19 星期一 標 本 的 運 輸在標本運輸過程中，應確保標本能夠及時、準確運輸?shù)街付ǖ攸c。要求提前與對方聯(lián)系，確定時間，對方應提前做好相關實驗的準備工作，盡快進行標本處理運輸?shù)乃袠吮径紤兴蜋z單給接受樣品的實驗室。每張送檢單都應詳細填寫所要求的內容.352021/7/19 星期一樣 品 的 運 輸 運

14、 送(續(xù))盡可能快地將樣品送至免疫表型檢測實驗室。如需運送樣品到其它地點時，應將裝樣品的試管放于一個防漏的容器中，并將此容器放于一個裝有吸水性物質的指罐中，以防止震動并可吸收所有試管破裂漏出的血液。蓋緊指罐，用橡皮帶系緊。應選擇特定的方案，并且安排合適的時間和運輸樣品。362021/7/19 星期一樣 品 的 接 收 樣品到達以后立即檢查試管及其所裝的血樣。不可檢測溶血或結冰樣品。不可檢測凝血和乳糜的樣品。如果樣品的采集時間已超過48H，不于接收.372021/7/19 星期一 標 本 的 處 理一般采集HIV-1感染者全血10 - 20ml 血漿（含有血小板）淋巴細胞層紅細胞層1 抗 凝 2

15、 無 菌3 室 溫4 24h內處理382021/7/19 星期一實現(xiàn) CD4, CD8 , CD3 絕對計數(shù)FACSCount結果可信度：絕對計數(shù)質控內置錯誤自動報警392021/7/19 星期一FACSCount內置微處理器實現(xiàn)數(shù)據自動分析自動打印質控與病人的檢測結果簡單易用的系統(tǒng)控制面板配套的樣本制備工作臺樣本制備方法簡捷，避免細胞損失402021/7/19 星期一FACSCount 試劑與對照FACSCount 工作臺FACSCount 完善的系統(tǒng)412021/7/19 星期一每管加入 50ml 全血加入，混勻，室溫避光孵育1h無需溶血1每管加入 50ml 固定液，混勻，室溫避光孵育30

16、min無需離心洗滌2FACSCount上機檢測.無需血球計數(shù)儀，直接得到絕對值結果33步測定CD4, CD8 ，CD3 絕對計數(shù)422021/7/19 星期一預配試劑FACSCount 完善的系統(tǒng)432021/7/19 星期一FACSCount 完善的系統(tǒng)檢測試劑盒組成（50人份/盒）熒光試劑2個組合/人份CD4PE/CD3PE-CY5CD8PE/CD3PE-CY5固定液效期 28 0C儲存6個月442021/7/19 星期一FACSCount 完善的系統(tǒng)質控試劑盒（50人份/盒）零，低，中，高 4種靶值微球效期 28 0C儲存1個月452021/7/19 星期一FACSCount3步測定CD

17、4, CD8 ，CD3 絕對計數(shù)462021/7/19 星期一每管加入 50ml 全血加入，混勻，室溫避光孵育1h無需溶血1FACSCount472021/7/19 星期一FACSCount每管加入 50ml 固定液，混勻，室溫避光孵育30min無需離心洗滌2482021/7/19 星期一FACSCount上機檢測.無需血球計數(shù)儀，直接得到絕對值結果3FACSCount492021/7/19 星期一打印結果 對照 病人標本FACSCount 分析502021/7/19 星期一實驗資料的記錄實驗應及時、準確地記錄結果。實驗記錄中應包括以下內容：日期、操作者、所有樣品、實驗內容、過程（步驟）、結果及有無事故等。整個實驗室的實驗資料要統(tǒng)一有專人負責，按固定格式記錄在案。計算機生成的實驗結果，存檔備案：定期拷貝計算機結果文檔，備案保存。512021/7/19 星期一HIV/AIDS CD4檢測時間一經抗-HIV確證的HIV/AIDS，應立即進行CD4細胞檢測。（基線）CD4細胞數(shù)200個/UL,每