天然藥化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū) (1)(共9頁(yè))

1、 PAGE 10天然藥物(yow)化學(xué)實(shí)驗(yàn)(shyn)課程(kchng)實(shí) 驗(yàn) 指 導(dǎo) 書(shū)主撰人 解軍波審核人 天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院二零零九年十月前 言實(shí)驗(yàn)(shyn)總體目標(biāo)天然藥物是人類(lèi)防病治病藥物的一個(gè)重要來(lái)源。提取、分離天然藥物中具有生理活性的化學(xué)成分，是天然藥物化學(xué)研究的一個(gè)重要課題。天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)主要是學(xué)習(xí)天然藥物有效成分的提取、分離、純化、鑒定的方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，加深學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的深入理解，訓(xùn)練學(xué)生的基本操作技能，培養(yǎng)學(xué)生分析(fnx)問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，為將來(lái)從事相關(guān)研究打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)踐基礎(chǔ)。 適用專(zhuān)業(yè)(zhuny)年級(jí) 制藥工程專(zhuān)業(yè) 三年級(jí)（第五學(xué)期） 先修

2、課程 分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)溫度為20,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對(duì)濕度一般應(yīng)保持在5070。 實(shí)驗(yàn)室的噪音、防震、防塵、防腐蝕等方面的環(huán)境條件應(yīng)符合在室內(nèi)開(kāi)展的檢定項(xiàng)目之檢定規(guī)程。5. 實(shí)驗(yàn)總體要求 提取、分離、純化、鑒定是貫穿于天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程的基本操作單元。正確掌握和靈活處理各個(gè)環(huán)節(jié)的操作技能是訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)格認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度與良好工作習(xí)慣，促進(jìn)理論與實(shí)踐結(jié)合的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生掌握、熟悉天然藥物化學(xué)提取、分離、鑒識(shí)技術(shù)的基本原理與基本方法，能夠進(jìn)行日常的天然藥物研究工作。6.本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)、難點(diǎn)及教學(xué)方法建議為了保證實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行和培養(yǎng)學(xué)生良好的實(shí)驗(yàn)作風(fēng)及保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，學(xué)

3、生必須遵守下列要求： 1、實(shí)驗(yàn)前必須充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)講義，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁螅乐箤?shí)驗(yàn)盲目性，講求實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。2、實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格按照規(guī)范操作進(jìn)行，仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，認(rèn)真記錄有關(guān)數(shù)據(jù)。要善于思考，學(xué)會(huì)運(yùn)用所學(xué)理論知識(shí)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，研究實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題。3、重視安全操作，遵守(znshu)實(shí)驗(yàn)室安全守則，使用易燃、易爆、有毒物品時(shí)要小心謹(jǐn)慎，避免事故發(fā)生。4、要認(rèn)真(rn zhn)寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)告要清楚、簡(jiǎn)練、整潔。實(shí)驗(yàn)(shyn)一 從三棵針中提取、分離小檗堿與小檗胺 三棵針為小檗屬(Berberis)植物，種類(lèi)繁多，是黃連、黃柏的重要代用品。根中含多種生物堿，有季胺類(lèi)生物堿，如小檗堿(Berberi

4、ne)1.23，根皮含35.5，少量巴馬亭(Palmatine)、藥根堿(Jatrorrhigine)、非洲防己堿(Columbamine)、木蘭花堿(Magnoflorine)，有叔胺堿，如小檗胺(Berbamine)0453.84，尖刺堿(Oxyacanthine)，異粉防己堿(1sotetrandrine)等。 小檗堿是一種常用的抗菌藥，對(duì)菌痢、腸炎、上呼吸道感染等疾病有良好的療效。小檗胺有升白、降壓、利膽及鎮(zhèn)咳等作用，對(duì)預(yù)防和治療白細(xì)胞減少療效較好。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?l、了解小檗堿，小檗胺的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，掌握提取分離方法。 2、了解小檗堿，小檗胺的鑒識(shí)反應(yīng)及薄層色譜鑒別。 二、實(shí)驗(yàn)原理l、

5、小檗堿(Berberine)又名黃連素 黃色針晶，能緩緩溶于水(1：20)、乙醇(1：100)，易溶于熱水及熱乙醇，難溶于乙醚、石油醚、苯及氯仿。 2、小檗胺(Berbamine) 白色或無(wú)色結(jié)晶，難溶于水，易溶于乙醇中，可溶于乙醚，氯仿、石油醚。 本實(shí)驗(yàn)的提取分離原理是：小檗堿、小檗胺的硫酸鹽易溶于水，小檗堿的鹽酸鹽難溶于水，小檗胺的鹽酸鹽可溶于水，游離的小檗堿為季胺堿可溶于水，游離的小檗胺是叔胺堿，難溶于水。因此，將植物原料用稀H2SO4溶液浸泡，然后用石灰乳調(diào)至pHl2左右，小檗堿游離而溶于水，小檗胺含酚羥基成鈣鹽也溶于水，粘液質(zhì)及過(guò)量硫酸生成不溶性鈣鹽而沉淀析出，再加NaCl，并用鹽酸

6、調(diào)pH8左右時(shí)，小檗堿成難溶性的氯化小檗堿而析出，小檗胺游離析出，最后利用氯化小檗堿在熱水中溶解度較大的性質(zhì)與小堿胺分離。 三、實(shí)驗(yàn)(shyn)內(nèi)容 (一)小檗堿與小檗胺的提取(tq)分離 取三棵針粗粉100克，置1000毫升(ho shn)三角瓶?jī)?nèi)，加700毫升0.2(VV)的H2SO4溶液，80下浸泡2小時(shí)，紗布過(guò)濾，置濾液于大燒杯內(nèi)，攪拌下加入石灰乳至pHl2，靜置30分鐘，抽濾，濾液中加入計(jì)算量(8WV)的NaCl，靜置，待沉淀完全后，滴加濃HCl至PH88.5，于80熱水中保溫半小時(shí)，靜置，抽濾，所得沉淀于60以下干燥，稱(chēng)重，置100毫升燒杯中，加入30倍量蒸餾水，加熱至沸，趁熱抽濾

7、，濾液內(nèi)含小檗堿，沉淀為小檗胺的粗品。 (二)精制：趁熱向上述濾液中滴加濃鹽酸，調(diào)pH至2，靜置鹽酸小檗堿沉淀析出，抽濾，60以上干燥，即得鹽酸小檗堿。 上步所得沉淀，60以下干燥，稱(chēng)重，置50毫升燒杯中，加20倍量乙醇加熱溶解，加入2活性炭，再加熱煮沸5分鐘，熱過(guò)濾，濾液蒸除乙醇，剩l4量，冷卻，滴加蒸餾水至不再析出沉淀為止，用5NaOH調(diào)pH88.5，80水浴加熱5分鐘左右，放置，抽濾，干燥。 (三)薄層色譜 層析板：硅膠G板，110，活化半小時(shí)。 展開(kāi)劑：氯仿甲醇氨水(15：4：0.5) 樣品：氯化小檗堿乙醇液 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品液 小檗胺乙醇(y chn)液 小檗胺標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)品

8、液 顯色：碘蒸汽(zhn q)或改良磺化鉍鉀 四、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明及注意事項(xiàng)： 1、用硫酸浸泡時(shí)，硫酸的濃度以0.2為宜，此時(shí)生成的硫酸小檗堿在水中溶解度較大，若加入過(guò)量，小檗堿就形成酸式硫酸鹽，水中溶解度就降低(1：100)，影響小檗堿的提取量。 2、冷浸時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，次數(shù)也不宜過(guò)多，否則浸出的雜質(zhì)量也相對(duì)增加，冷浸一般24小時(shí)可浸出92的成分,所以浸出兩次即可。 3、在pH8.5時(shí)小檗胺沉淀較完全，但不易凝聚，故80保溫，使凝聚而沉降。 4、小檗堿精制時(shí)調(diào)pH至2，是為了使小檗胺等叔胺型生物堿留在溶液中除去，以便得到較純的小檗堿，操作時(shí)若溶液己冷卻析出結(jié)晶，就應(yīng)加熱成澄明溶液再用鹽酸調(diào)pH2。實(shí)驗(yàn)

9、二 甘草酸的制備與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握高速逆流色譜分離純化的原理2、熟悉高速逆流色譜、中壓制備色譜的操作方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容利用高速逆流色譜等方法制備甘草酸，并進(jìn)行鑒別。三、實(shí)驗(yàn)要求以學(xué)生自主訓(xùn)練為主的開(kāi)放(kifng)模式組織教學(xué)，讓學(xué)生(xu sheng)熟悉高速逆流(nli)色譜的操作及其注意事項(xiàng)。四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備復(fù)習(xí)天然藥物化學(xué)中的相關(guān)知識(shí)，預(yù)習(xí)相關(guān)方法和相關(guān)事項(xiàng)。五、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段1、HSCCC利用了一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)(單向流體動(dòng)力學(xué)平衡)現(xiàn)象。其原理是基于樣品在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的互不混溶的兩相溶劑間分配不同而獲得分離，因而無(wú)須任何固體載體或支撐體，能達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離和制備

10、，并且可以達(dá)到幾千個(gè)理論塔板數(shù)。與其他柱色譜相比較，它克服了固定相載體帶來(lái)的樣品吸附、損失、污染和峰形施尾等缺點(diǎn)。2、甘草酸：本品為白色粉末，有甜味。分子式及分子量：C42H62O16 822.92。熔點(diǎn)220,有特殊甜味, ,溶于熱水和熱的稀乙醇,不溶于無(wú)水乙醇。六、實(shí)驗(yàn)條件TBE-300A型高速逆流色譜儀系統(tǒng)、中壓色譜系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、真空泵、真空干燥箱、熔點(diǎn)測(cè)定儀分液漏斗、燒杯、表面皿反相硅膠(u jio)（SP-120-40/60-ODS-B）、乙酸乙酯、甲醇(ji chn)、乙醇、正丁醇、丙酮、鹽酸(yn sun)、氨水皆為分析純，蒸餾水、甘草藥材 甘草酸對(duì)照品七、實(shí)驗(yàn)步驟1甘草酸粗

11、提物的制備：取甘草藥材100g，粉碎，過(guò)篩（40目），用95乙醇（1：4）超聲提取三次，每次45分鐘。合并提取液減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得褐色浸膏。在浸膏中加2NaOH溶解，過(guò)濾，濾液用2HCl酸化至不再有沉淀生成，過(guò)濾，濾渣用冰水洗滌后用真空干燥器在50下干燥，得甘草酸粗品。2高速逆流色譜分離：2.1供試液的制備：精密稱(chēng)取甘草酸粗品100mg，溶解于10ml乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）上層溶液中。2.2分離純化：將供試液注于色譜儀中，收集相應(yīng)部位，回收溶劑，得純度較高的甘草酸。分離條件如下：固定相 乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）（氨水適量） 流動(dòng)相 乙酸乙酯-正丁醇-水（5

12、：1.5：5）（氨水適量） 流速(li s) 1.5ml/min 轉(zhuǎn)速 1000rpm 溫度(wnd) 25 檢測(cè)(jin c)波長(zhǎng) 254nm3中壓色譜分離：3.1 裝柱 取反相硅膠500g, 于105活化2h后，取出放置室溫即可裝柱。柱子采用干法填充，填滿(mǎn)整個(gè)柱體，不留死體積。3.2取第3步所得甘草酸，取10ml丙酮溶解，上樣，泵人中壓柱柱頭，以甲醇-水（50：50），25mlmin的流速進(jìn)行洗脫，254nm波長(zhǎng)檢測(cè)，收集相應(yīng)部位，真空干燥，得甘草酸純品。4測(cè)定紫外圖譜，鑒定。八、思考題1高速逆流色譜選用分離溶劑體系的原則是什么？2天然產(chǎn)物的純度測(cè)定常用的方法？九、實(shí)驗(yàn)報(bào)告認(rèn)真寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)