新編-分子生物學課件第二章DNA的結構

1、第二章 染色體與DNA內(nèi)容提要DNA的結構DNA的二級結構的多態(tài)性和動態(tài)性DNA的變性和復性DNA超螺旋和拓撲異構酶基因組大小與C值矛盾原核生物染色體及其基因真核生物染色體及其基因DNA的復制原核和真核生物DNA的復制特點DNA的修復DNA的轉座DNA的一級結構：DNA的共價結構和核苷酸順序。DNA的二級結構：一定或全部核苷酸序列所形成的規(guī)律性結構。DNA的三級結構：染色體DNA所具有的復雜折疊狀態(tài)。 DNA結構有多樣性，這些多樣性的結構還會相互轉變，處在動態(tài)中。DNA的一級結構：DNA的共價結構和核苷酸順序。DNA攜帶兩類不同的遺傳信息：一類是負責蛋白質(zhì)氨基酸組成的信息；另一類是關于基因選擇

2、性表達的信息。第一節(jié) DNA的一級結構脫氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯鍵聚合成為脫氧核糖核酸（DNA）鏈。鏈的一端的核苷酸有自由的5磷酸基團，稱5端；另一端核苷酸具有自由的3羥基，稱3端。交替的磷酸和2-脫氧核糖構成分子的骨架，堿基為側鏈，堿基類似于蛋白質(zhì)氨基酸的側鏈，影響著所形成的核酸的結構和功能。 堿基的疏水特性 堿基形成氫鍵的特性DNA的堿穩(wěn)定性DNA對堿相對穩(wěn)定RNA在堿性溶液中易降解為2，3環(huán)式單核苷酸中間產(chǎn)物，然后很快轉變?yōu)? 單核苷酸和3單核苷酸。DNA結構的表示法DNA一級結構的重要性攜帶遺傳信息決定DNA的二級結構決定DNA的空間結構第二節(jié) DNA的雙螺旋結構繞DNA雙螺旋表面

3、上出現(xiàn)的螺旋槽（溝），寬的溝稱為大溝，窄溝稱為小溝。大溝，小溝都是由于堿基對堆積和糖-磷酸骨架扭轉造成的。右手雙螺旋結構模型的要點：1 主鏈:2 堿基對3 螺距4 大溝和小溝主鏈是由兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構成的右手螺旋結構，脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架兩條鏈上的堿基以氫鍵相連，G與C配對，A與T配對。嘌呤和嘧啶堿基對層疊于雙螺旋的內(nèi)側C-GT-A8.5 11.7 7.5 5.7 Major GrooveMinor Groove大溝和小溝，特別是大溝，對于在遺傳上有重要功能的蛋白質(zhì)識別DNA雙螺旋結構上的特定信息是非常重要的，只有在溝內(nèi)，蛋白質(zhì)才能“感覺”到不同

4、堿基順序，而在雙螺旋結構的表面全是相同的磷酸和脫氧核糖的骨架，沒有什么信息可言。決定雙螺旋結構狀態(tài)的因素（一）氫鍵1 . 堿基的氫供體氨基、羥基2. 堿基的氫受體酮基、亞氨基3. GC對及AT對之間的氫鍵在一定范圍內(nèi)DNA的穩(wěn)定性與GC百分含量成正比Tm=69.3+0.41(%G+C)4. 氫鍵數(shù)對DNA雙鏈穩(wěn)定性的影響5. 堿基之間形成氫鍵的條件互補性方向性（二）堿基堆集力1. 堿基堆集力同一條鏈中的相鄰堿基之間的非特異性作用力2. 堿基堆集力的來源疏水作用累積的Van der Waal的作用力3. 堿基堆集作用的證據(jù)單鏈多核苷酸傾向于堿基平行排列的規(guī)則螺線結構破壞疏水作用和雙鏈的氫鍵可降低

5、DNA的穩(wěn)定性（三）帶電荷的磷酸基的靜電斥力磷酸集團的負電對DNA雙鏈的穩(wěn)定性起負作用。陽離子可對之產(chǎn)生屏蔽。DNA溶液的離子濃度越低，DNA越不穩(wěn)定。（四）堿基分子內(nèi)能堿基內(nèi)能越高，氫鍵和堿基堆積力越容易被破壞，DNA雙鏈越不穩(wěn)定嘌呤和嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋結構穩(wěn)定性的影響 堿基組成相同，但嘌呤和嘧啶的排列順序不同，雙螺旋的穩(wěn)定性具有顯著的差異。從嘌呤到嘧啶的方向的堿基堆集作用顯著大于同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的堿基堆集作用。 5 TA 3 的Tm值最低。 TATA框：RNA聚合酶的結合位點。 UAA：終止密碼子。第三節(jié) DNA的二級結構的多態(tài)性和動態(tài)性右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋

6、：Z-DNAB-DNA構象： 相對濕度為92%時，DNA鈉鹽纖維為B-DNA構象。在天然情況下，絕大多數(shù)DNA以B構象存在。A-DNA構象： 當相對濕度改變（75%以下）或由鈉鹽變?yōu)殁淃}、銫鹽，DNA的結構可成為A構象。它是B-DNA螺旋擰得更緊的狀態(tài)。DNA-RNA雜交分子、RNA-RNA雙鏈分子均采取A構象。Z-DNA構象： 在一定的條件下（如高鹽濃度），DNA可能出現(xiàn)Z構象。Z-DNA是左手雙螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大溝，小溝窄而深，并具有更多的負電荷密度。 Z-DNA的存在與基因的表達調(diào)控有關。B-DNA、A-DNA及Z-DNA結構特征比較 B-DNA A-DNA Z-D

7、NA每圈bp數(shù) 10-10.6 11 12每bp轉角（度） +34.6 +34.7 -30每bp上升距離（A） 3.38 2.56 3.71螺旋直徑（A） 19 23 18B-DNA是最常見的DNA構象；A-DNA和Z-DNA可能具有不同的生物活性?，F(xiàn)已證明，左手Z-DNA（1979，Rich）只是右手螺旋結構模型的一個補充和發(fā)展。Z-DNA調(diào)控基因轉錄的兩個模式Z-DNA調(diào)控基因轉錄的兩個模式第四節(jié) DNA的雙螺旋結構的呼吸作用雙螺旋DNA結構中，配對堿基之間的氫鍵處于連續(xù)不斷的斷裂和再生的動態(tài)平衡之中，這種氫鍵的迅速斷裂和再生過程稱為DNA鏈的呼吸作用。在富含AT的節(jié)段，呼吸作用更為明顯，

8、常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結構，這對于某些特殊的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生反應并閱讀DNA鏈內(nèi)部儲藏的信息具有重要作用。作業(yè)：1、 DNA雙螺旋模型是哪年、由誰提出的?簡述其基本內(nèi)容。2、DNA的雙螺旋結構有哪幾種不同形式，各有何特點？第五節(jié) DNA的變性和復性DNA的變性：DNA雙鏈的氫鍵斷裂，逐步變?yōu)榻朴跓o規(guī)則線團的過程稱為變性。DNA的變性發(fā)生在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)。增色效應：在變性過程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當達到某一溫度時驟然上升，稱為增色效應。吸收值的驟然上升表明DNA的變性是一協(xié)同性過程。融解溫度（Melting temperature Tm )：變性過程紫外線吸收值增加的中點

9、的溫度稱為融解溫度。 生理條件下一般為85-95。影響因素：G+C含量，pH值，離子強度，尿素，甲酰胺等。計算Tm值的經(jīng)驗公式：在0.15mol/L NaCl+0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中，當DNA長鏈G+C百分含量在30%70%時 Tm = 69.3+0.41（G+C）%當DNA鏈長度18nt時，可近似認為 Tm = 4（G+C）+2（A+T）Effect of Salt on Tm復性（Renaturation)：熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復成雙鏈。減色效應：隨著DNA的復性，260nm紫外線吸收值降低的現(xiàn)象。 （一）復性的條件1，消除磷酸基的靜電斥力；2，破壞鏈內(nèi)氫鍵（二）復性

10、的機制1.隨機碰撞取決于DNA濃度、溶液溫度、離子強度等2.成核作用（nucleation)3.拉鏈作用（zippering）復性的條件：足夠的鹽濃度以消除磷酸基的靜電斥力，常用的鹽濃度為0.150.5mol/L的NaCl；足夠高的溫度以破壞無規(guī)則的鏈內(nèi)氫鍵，但又不能太高，否則配對堿基之間的氫鍵難以形成；一般使用比Tm值低 2025的溫度。雜交復性DNA中，如果兩條鏈來源不同，稱雜交分子。重要的雜交技術：Southern BlottingNorthern Blotting形狀:雙股（ds)線型、環(huán)型，單股（ss）環(huán)型大小真核生物DNA復性動力學 DNA的復雜性（復雜長度）：動力學復雜長度 4.

11、2106bp樣品DNAC0t1/2/大腸桿菌DNAC0t1/2 化學復雜長度：用化學方法測量的DNA的長度。 重復頻率f=化學復雜長度/動力學復雜長度第六節(jié) DNA的形狀、大小和序列組織Figure 3.6 The reassociation kinetics of eukaryotic DNA show 3 types of component (indicated by the shaded areas). The arrows identify the Cot1/2 values for each component.3.2 Eukaryotic genomes have several

12、 sequence components不重復序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等 功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。中度重復序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101103。 如：rRNA、tRNA 一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達中起重要作用 高度重復序列：拷貝數(shù)達到幾百個到幾百萬個。 Alu家族，B1家族衛(wèi)星DNA：A T含量很高的簡單高度重復序列。第七節(jié) DNA超螺旋和拓撲異構酶DNA的高級結構1） 定義：指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結構。是一種比雙螺旋更高層次的空間構象。2）主要形式：超螺旋結構（正超螺旋

13、和負超螺旋）線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋正超螺旋和負超螺旋（一）形成超螺旋的原因和條件原因：因某種原因引入了額外的螺旋條件：A、 DNA雙螺旋閉合或被蛋白結合，末端不能自由轉動；B、 DNA雙鏈上無斷裂L=T+WL：DNA的連接數(shù) T：盤繞數(shù) W：超盤繞數(shù)（二）正超螺旋（三）負超螺旋超螺旋的意義影響DNA高級結構的酶 拓撲異構酶 L值的改變需要至少一條DNA鏈斷裂一次。斷裂造成的DNA自由末段的一端可繞著另一端旋轉，隨后被重新連接，DNA拓撲異構酶通過催化此類反應將DNA從一種拓撲結構轉變成另一種。拓撲異構酶or溴化乙錠拓撲異構酶or溴化乙錠DNA扭曲與雙螺旋相同（擰緊）DNA

14、扭曲與雙螺旋相反（松開）負超螺旋松弛DNA正超螺旋第八節(jié) 基因組大小與C值矛盾C-值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。C-值矛盾（C-value paradox)： 形態(tài)學的復雜程度（物種的生物復雜性）與C-值大小的不一致，稱為C值矛盾（C-值悖理）真核細胞基因組的最大特點是它含有大量的重復序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開。 The C-value paradox refers to the lack of a correlation between genome size and genetic complexity. We know that genes

15、are much larger than the sequences needed to code for proteins, because exons (coding regions may comprise only a small part of the total length of a gene. This explains why there is much more DNA than is needed to provide reading frames for all the proteins of the organism. Large parts of an interr

16、uped gene may not be concerned with coding for protein. And there may also be significant lengths of DNA between genes. 真核細胞DNA序列可被分為3類：1、不重復序列。 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的10%80%。不重復序列長約7502 000bp，相當于一個結構基因的長度。 蛋清蛋白、蠶的絲心蛋白、血紅蛋白和珠蛋白等都是單拷貝基因。2、中度重復序列 這類序列的重復次數(shù)在101104之間，占總DNA的10%40%。 如小鼠中占20%，果蠅中

17、占15%，各種rRNA、tRNA以及某些結構基因如組蛋白基因等都屬于這一類。 非洲爪蟾這些基因（28S、5.8S、18S）及間隔區(qū)組成的單位在DNA鏈上串聯(lián)重復約5000次。 在動物卵細胞形成過程中，rDNA（就是可以轉錄產(chǎn)生rRNA的基因 ）可進行幾千次不同比例的復制，產(chǎn)生2106個拷貝，使rDNA占卵細胞DNA的75%，從而使該細胞能積累1012個核糖體，以合成大量蛋白質(zhì)供細胞分裂之需。3、高度重復序列衛(wèi)星DNA 只存在于真核生物中，占基因組的10%60%，由6100個堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復高達數(shù)百萬次。 衛(wèi)星DNA不轉錄，其功能不詳。它們是異染色質(zhì)（異染色質(zhì)在間期的復制晚于常染色

18、質(zhì)）的成份，可能與染色體的穩(wěn)定性有關。第九節(jié) 原核生物染色體及其基因組The nucleoid spills out of a lysed E. coli cell in the form of loops of a fiber. Photograph kindly provided by Jack Griffith.The bacterial genome is a nucleoid with many supercoiled loops細菌的基因組是一個有許多超螺旋環(huán)的核酸Figure 18.6 The bacterial genome consists of a large number

19、 of loops of duplex DNA (in the form of a fiber), each secured at the base to form an independent structural domain.The bacterial genome is a nucleoid with many supercoiled loops大腸桿菌的一些DNA結合蛋白經(jīng)濟有效，不編碼序列少，一般無內(nèi)含子功能上相關的幾個結構基因前后相連，形成操縱子蛋白質(zhì)基因通常以單拷貝的形式存在RNA基因通常是多拷貝的各種基因的啟動子和操作子部分的DNA序列多種多樣，以便與RNA聚合酶及阻遏蛋白發(fā)

20、生不同程度的結合，對基因的表達進行精細的調(diào)節(jié)重疊基因和基因內(nèi)基因原核生物基因 原核生物基因組原核生物的基因組很小，大多只有一條染色體，且DNA含量少，如大腸桿菌DNA的相對分子質(zhì)量僅為4.6106bp，其完全伸展總長約為1.3mm，含4000多個基因。 原核生物基因主要是單拷貝基因，只有很少數(shù)基因如rRNA基因以多拷貝形式存在； 整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成； 幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對應狀態(tài)。原核細胞DNA特點：1、結構簡煉。 原核DNA分子的絕大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，只有很小一部分控制基因表達的序列不轉錄。如在X174中不轉錄部分只占4%左右（

21、217/5386),T4 DNA中占5.1%（282/5577)。2、存在轉錄單元 原核生物DNA序列中功能相關的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往叢集在基因組的一個或幾個特定部位，形成轉錄單元并轉錄產(chǎn)生含多個mRNA的分子，稱為多順反子mRNA。3、有重疊基因。 一些細菌和動物病毒存在重疊基因，同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白質(zhì)的信息。 1973年，Weiner和Weber在研究一種大腸桿菌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)，有兩個基因從同一起點開始翻譯，一個在400bp處結束，而在3%的情況下，翻譯可一直進行下去直到800bp處碰到雙重終止信號時才停止。1977年，Sanger正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因： X174感染寄主后共

22、合成9個蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約2.5105，相當于6 078個核苷酸，而病毒DNA本身只有5 375個核苷酸。 Sanger在弄清X174 DNA的全部核苷酸序列及各個基因的起迄位置和密碼數(shù)目以后發(fā)現(xiàn)，9個基因中有些是重疊的。組蛋白： H1 H2A H2B H3 H4非組蛋白核小體DNA蛋白質(zhì)染色體真核生物染色體的組成第十節(jié) 真核生物染色體及其基因端粒，著絲點和DNA復制原點是構成染色體不可缺少的三個要素組蛋白的一般特性：進化上的保守性保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H4無組織特異性肽鏈氨基酸分布的不對稱性H5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸（24%）組蛋白的可修飾性組蛋白的一般特性：1、進

23、化上的極端保守性保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H4不同種生物組蛋白的氨基酸組成十分相似。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同，與豌豆序列相比也只有兩個氨基酸的差異。2、無組織特異性 僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5，精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白這兩個例外。3、肽鏈上氨基酸分布的不對稱性 堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上，而大部分疏水基團都分布在C端。 堿性的半條鏈易與DNA的負電荷區(qū)結合，而另外半條鏈與其他組蛋白、非組蛋白結合。4、組蛋白的修飾作用 如甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。修飾作用只發(fā)生在細胞周期的特定時間和組蛋白的特定位點上。 H3、H

24、4的修飾作用較普遍。5、 H5組蛋白的特殊性： 富含賴氨酸（24%）； 還富含16%丙氨酸、13%絲氨酸、11%精氨酸。組蛋白的可修飾性 在細胞周期特定時間可發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔?、H1有磷酸化作用。 所有這些修飾作用都有一個共同的特點，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結構，直接影響轉錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉錄活性。 非組蛋白非組蛋白占組蛋白總量的6070%，主要包括酶類、與細胞分裂有關的收縮蛋白、骨架蛋白、核孔復合物蛋白以及肌動蛋白、

25、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白等。 非組蛋白的多樣性:非組蛋白種類約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。 非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。（1）高速泳動蛋白（HMG）：富含賴AA、精AA、谷AA與天冬AA，與DNA的超螺旋結構有關（2）DNA結合蛋白：與DNA的復制或轉錄有關的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)（3）A24非組蛋白：與H2A差不多大小，呈酸性，含谷AA與天冬AA多，于核小體內(nèi)，功能不詳核小體(nucleosome)1、定義：用于包裝染色質(zhì)的結構單位，是由DNA鏈纏繞一個組蛋白核心構成的。 2、核小體的結構核心顆粒、連接區(qū)DNALimited Micrococcal Nulcease Di

26、gestion of Chromatin Generates a 200 bp LadderH1H1H1H1H1H1Micrococcal Nuclease Digestion TimeMononucleosomeChromatosome染色質(zhì)小體Core ParticleLinker DNA (variable)Operational Definititions of Nucleosome ParticlesChromatin6.8:140:11000:18000:1DNA double helixNucleosome (10 nm fiber)30 nm FiberLoops ILoops

27、 IIchromosome3、染色體的包裝真核生物的基因不連續(xù)基因 外顯子，內(nèi)含子基因家族與基因簇基因家族：一組來源相同、結構相似、功能相關的基因。 假基因串聯(lián)重復基因 組蛋白基因 rRNA基因 tRNA基因細胞器基因 線粒體基因，葉綠體基因 基因組很小，大多只有一條染色體結構簡煉存在轉錄單元(trnascriptional operon) 多順反子(polycistron)有重疊基因（Sanger發(fā)現(xiàn)）X174 D-E-J-F-G-H mRNA 蛋白J、F、G H D EE.coli 色氨酸操縱子 9個順反子 9個酶第十一節(jié)原核生物與真核生物基因組結構特點的比較1、原核生物基因組結構特點 基

28、因內(nèi)基因 部分重疊基因 一個堿基重疊2、真核生物基因組結構特點真核基因組結構龐大 一般遠大于原核的含有大量重復序列非編碼序列多 多于編碼序列(9:1)轉錄產(chǎn)物為單順反子基因不連續(xù)性 斷裂基因（interrupted gene）、內(nèi)含子(intron)、 外顯子(exon)存在大量的順式作用元件。 啟動子、增強子、沉默子等存在大量的DNA多態(tài)性（DNA序列中發(fā)生變異面導致的個體間核苷酸序列的差異端粒結構作業(yè)：1、簡述DNA的C-值以及C-值矛盾（C Value paradox）。2、簡述真核生物染色體上組蛋白的種類，組蛋白修飾的種類及其生物學意義。（中國科學院2019年碩士研究生入學生物化學與分

29、子生物學試題）3、比較原核、真核基因組的特點（上海第二軍醫(yī)大碩士研究生入學考試試題）DNA的復制生命的遺傳是染色體DNA自我復制的結果，主要是通過半保留復制來實現(xiàn)的，是一個以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過程。親代DNA以自身分子為模板來合成新的分子，并分配到兩個子細胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。DNA分子由兩條多核苷酸鏈組成，兩條鏈上的堿基G與C配對，A與T配對；兩條鏈是互補的，一條鏈上的核苷酸排列順序決定了另一條鏈上的核苷酸排列順序。DNA的復制包括復制的起始、延伸和終止三個階段。DNA Replication DNA replication is semi-conservat

30、ive, one strand serves as the template for the second strand. Furthermore, DNA replication only occurs at a specific step in the cell cycle. The following table describes the cell cycle for a hypothetical cell with a 24 hr cycle. Stage Activity Duration G1 Growth and increase in cell size 10 hr S DN

31、A synthesis 8 hr G2 Post-DNA synthesis 5 hr M Mitosis 1 hr DNA replication has two requirements that must be met: 1.DNA template 2.Free 3 -OH group 1、定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式稱半保留復制。（一）DNA的半保留復制（semi-conservative replication）“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“l(fā)ight” DNA “Hybr

32、id” DNA2、實驗證據(jù)（1958 Meselson 和Stahl ）：3、DNA半保留復制的生物學意義： DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。（二）與DNA復制有關的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA ，這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。 5、 DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶以四種脫氧核苷酸

33、三磷酸為底物反應需要有模板的指導反應需要有3-OH存在DNA鏈的合成方向為5 3 性質(zhì) 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+主要是對DNA損傷的修復；以及在DNA復制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復紫外光引起的DNA損傷DNA 復制的主要聚合酶，還具有3-5外切酶的校對功能，提高DNA復制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌） 定位 細胞核 細胞核 線粒體 細胞核 細胞核3-5外切 - - + + +酶活性功能引物合成修復作用線粒體DNA的復制核DNA的復制復制修復真核生物中的DNA聚合酶真核細胞主要有5種D

34、NA聚合酶，分別為DNA聚合酶（定位于胞核，參與復制引發(fā)具53外切酶活性），（定位于核內(nèi)，參與修復，具53外切酶活性），（定位于線粒體，參與線粒體復制具53和35外切活性），（定位于核內(nèi)，參與復制，具有35和53外切活性），（定位于核內(nèi)，參與損傷修復，具有35和53外切活性）。 6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來 DNA連接酶在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用3535OHP7、DNA 拓撲異構酶(DNA Topisomerase

35、)： 拓撲異構酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉錄區(qū)，同轉錄有關。例：大腸桿菌中的蛋白 拓撲異構酶：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關。 例：大腸桿菌中的DNA旋轉酶8、DNA 解螺旋酶 /解鏈酶（DNA helicase) 通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3 5移動，而解螺旋酶I、II、III沿5 3移動。9、單鏈結合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單

36、鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。（三）DNA的復制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開 RNA引物的合成 DNA鏈的延伸 切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段復制的終止1、雙鏈的解開DNA的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。 ori(或o）、富含A、T的區(qū)段。復制起點是固定的，表現(xiàn)為固定的序列，并識別參與復制起始的特殊蛋白質(zhì)。 基本概念：從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子復制時，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復制點，這個復制點的形狀象一個叉子，故稱為復制叉復制叉復制叉復制方向和速度： 單起點、雙向等速多起點、雙向等速Electron Microscopy of r

37、eplicating DNA revealsreplicating bubbles. How does one provebidirectional fork movement?DNA的復制Pulse with radiolabeled nucleotide; chase with coldnucleotide. Then do autoradiography雙鏈解開、復制起始大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結合在HU蛋白和ATP的共同作用下,DNA復制起始復合物使3個13bp直接重復序列變性,形成開鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結合(需DnaC幫助),

38、進一步解開DNA雙鏈2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度約為幾個至10個核苷酸，DNA的半不連續(xù)復制DNA復制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復制。在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導鏈；合成方向與復制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。3、DNA鏈的延伸 在DNA復制過程中，前導鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53 的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。4、切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段 （復制終止）在DNA聚

39、合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈 5、復制終止a、終止序列 E.coli 有兩個終止區(qū)域，分別結合專一性的終止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每個區(qū)域只對一個方向的復制叉起作用 b、專一性終止蛋白 E.coli 中由 tus gene 編碼 通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用ter雙鏈環(huán)狀、型復制、雙向等速（四）DNA復制的其它方式線性DNA雙鏈的復制滾環(huán)型：單向復制的特殊方式如：174的雙鏈環(huán)狀DNA復制型（RF）T7 DNA的復制痘病病毒DNA的復制 線性D

40、NA的末端復制的問題(1）通過將線性復制子轉變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復制子）；(2）某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5端堿基共價結合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )。(3）DNA可形成特殊的結構，如在末端形成發(fā)夾。使分子沒有游離末端。草履蟲（Paramecium）的線性線粒體DNA的復制中就形成了一種交聯(lián)；(4）末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復制）?二聚體3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬菌體的末端復制專一性核酸內(nèi)切

41、酶 線性DNA 雙鏈的復制單一起點、單向，如：腺病毒 腺病毒（Adnovirus-2） DNA的復制 腺病毒 DNA 復制起始GIRIR長的發(fā)夾結構復制起始復不需引物,避免5-end shortent 不需RNA引物，在正鏈3OH上延伸;只有一個復制叉滾環(huán)復制D環(huán)復制單向復制的特殊方式如：動物線粒體DNA（五）真核生物中DNA的復制特點真核生物每條染色體上有多個復制起點，多復制子真核生物染色體在全部復制完之前,各個起始點不再重新開始DNA復制；而在快速生長的原核生物中，復制起點可以連續(xù)開始新的復制(多復制叉)。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。復制元相對較小(40-100kb), 復

42、制速度較慢,大 約5005000bp/min.真核生物有多種DNA聚合酶。組蛋白八聚體是以全保守的方式傳給子代分子的真核生物復制起始區(qū)酵母的復制起點稱為:自主復制順序(autonomously replicating sequence,ARS) ARS序列的共同特征：具有一個稱為A區(qū)的11個A-T堿基對的保守序列。起始需要起始點識別復合物ORC參與，ORC結合于ARS，它是由6種蛋白質(zhì)組成的復合物。 真核生物染色體 DNA末端補齊模式 (1) 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (富含 G 鏈)

43、3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含 C 鏈) （2） 端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling 四膜蟲 端粒酶 （ telomerase ）將T2G4 末端重復延伸 游撲蟲 Telomerase = RNA CAAAACCCC 鏈 + 末端結合蛋白 （TBP） 端粒酶逆轉錄酶a、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含約長150NT的RNA，其中含 15 拷貝的CxAy重復序列， 是合成端粒T2G4的模板c、延長的3-T2G4端（一段cDNA）作為5-端DNA合成

44、的模板（3） 補齊過程 通過TG鏈的回折形成 發(fā)夾結構（GG氫鍵） 尺蠖模型 實現(xiàn)端粒酶位置的 調(diào)整 G G hoogsteen 氫鍵 三螺旋DNA G鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- G鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- 大腸桿菌染色體DNA的復制調(diào)控Col

45、E1質(zhì)粒DNA的復制調(diào)控真核細胞DNA的復制調(diào)控:細胞生活水平調(diào)控染色體水平調(diào)控復制子水平調(diào)控 （六）基因組復制的調(diào)控作業(yè)：1、請設計一個實驗來證明DNA復制是以半保留方式進行的。（中國科學院上海生化與細胞所2019年招收碩士研究生分子遺傳學入學考試，8分）2、名詞解釋 ：岡崎片段，（華中科技大學2019年生物化學與分子生物學碩士研究生入學試題，3分） Replicon， semi-conservative replication （武漢大學2019年碩士研究生入學分子生物學試題）3、原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前導鏈和岡崎片段A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶

46、D、引物酶 （華中科技大學2019年生物化學與分子生物學碩士研究生入學試題）DNA的損傷與修復對于生命狀態(tài)存在和延續(xù)來說，DNA分子要求保持高度的精確性和完整性，細胞中沒有哪一種分子可以和它相比。在長期進化中，生物體不僅演化出能糾正偶然的復制錯誤的系統(tǒng)，而且還存在著能修復環(huán)境因素（如射線）和體內(nèi)化學物質(zhì)造成的DNA分子的損傷的系統(tǒng)。DNA的損傷堿基的脫落 AP位點堿基（或核苷）的改變錯誤堿基 堿基的缺失或插入嘧碇堿基的二聚化鏈的斷裂DNA鏈的交聯(lián)氧自由基對DNA的損傷DNA的修復DNA修復系統(tǒng)功能錯配修復恢復錯配堿基切除修復切除突變的堿基核苷酸切除修復修復被破壞的DNADNA直接修復修復嘧啶二

47、聚體或甲基化DNA易錯修復應急措施1、錯配修復Dam甲基化酶使母鏈位于5GATC序列中腺酸甲基化甲基化緊隨在DNA復制之后進行根據(jù)復制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基根據(jù)母鏈甲基化原則找出錯配堿基的示意圖發(fā)現(xiàn)錯配堿基在水解ATP的作用下，MutS， MutL與堿基錯配點的DNA雙鏈結合MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發(fā)現(xiàn)甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈 甲基化指導的錯配修復示意圖錯配堿基位于切口3下游端，錯配堿基位于切口5上游端，2、堿基切除修復 一些堿基在自發(fā)或誘變下會發(fā)生脫氨基，然后改變配對性質(zhì)，造成氨基轉換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對鳥嘌呤變?yōu)?/p>

48、黃嘌呤與胞嘧啶配對胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶如果復制發(fā)生就會產(chǎn)生一個突變糖苷水解酶識別改變了的堿基，把堿基從N-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為AP位點。由AP核酸內(nèi)切酶將受損核苷酸的糖苷-磷酸鍵切開。DNA連接酶連接利用DNA聚合酶I切除損傷部位，補上核苷酸3、核苷酸切除修復1）通過特異的核酸內(nèi)切酶識別損傷部位2）由酶的復合物在損傷的兩邊切除幾個核苷酸3） DNA 聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈4）DNA連接酶將切口補平識別損傷部位損傷的兩邊切除幾個核苷酸DNA 聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈DNA連接酶將切口補平4 、DNA的直接修復在

49、DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對光復活：光敏裂合酶在可見光300nm-600nm下活化而催化胸腺嘧啶二聚體分解成為單體。5、SOS修復SOS修復的概念：SOS修復是指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態(tài)時所誘導的一種DNA修復方式，修復結果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生存率，但留下的錯誤較多。 RecA蛋白在SOS修復中的作用RecA蛋白的主要生化活性重組活性單鏈DNA結合活性蛋白酶活性RecA蛋白的作用水解LexA蛋白LexA蛋白在在SOS修復中的作用 LexA蛋白的作用是一種阻遏蛋白,結合

50、于SOS系統(tǒng)中各基因的操縱子上,使得這些基因不能產(chǎn)生轉錄產(chǎn)物對自身基因的表達也有負向控制作用,但正常細胞中其表達量足以阻遏所有SOS基因的表達當細胞DNA復制受阻時，LexA蛋白被RecA蛋白觸發(fā)，發(fā)生自身催化的水解作用，SOS系統(tǒng)被激活，lexA基因表達也增加。DNA復制正常后,RecA蛋白失活,LexA蛋白恢復對SOS系統(tǒng)的阻遏作用由LexA控制的SOS基因構成一個調(diào)控元LexA控制17個基因,統(tǒng)稱din(damage inducible genes)基因,或SOS基因SOS框：所有SOS基因的操作子都含有20bp的LexA結合位點,稱為SOS框(SOS box)作業(yè)：扼要說明細胞中DNA

51、修復系統(tǒng)有哪幾種（8分）（中國科學院2019年碩士學位研究生入學分子遺傳學試題）DNA的轉座一、轉座成分概述（一）轉座成分的發(fā)現(xiàn)：50年代初，McClintock通過對玉米遺傳現(xiàn)象的精細研究，首先發(fā)現(xiàn)了能在基因組內(nèi)不同區(qū)域轉移的控制成分（Controlling elements）。（二）轉座子的概念基因組上不必借助于同源序列就可移動的DNA片段稱為轉座子（transposons）或轉座元件。轉座子的轉移過程稱為轉座。轉座作用涉及到轉座子的復制，當一個拷貝插入基因組的新位置，原來位置上仍可保留一個拷貝。因此轉座作用并不是轉座子由基因組的一處轉移到另一處的簡單過程。轉座頻率和自發(fā)突變的頻率相似，介

52、于每世代每細胞10-5-10-7之間，轉座子的切除頻率要低得多，介于每世代每細胞10-6-10-10之間。（三）原核生物轉座子的類型細菌中的轉座成分依組成結構可以分為以下幾類：插入序列（insertion sequences)，復合轉座子（composite transposons），TnA轉座子家族（ TnA family）和可轉移噬菌體（transposable phages）。轉座子的結構特征：轉座子具有反向末端重復序列以及具有編碼轉座酶的基因。插入序列（因其插入使靶點處基因失活而被發(fā)現(xiàn)）IS是最簡單的轉座子，不含有任何宿主基因，它們是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。IS的命名、分布及結構命名：以IS開頭，后加不同數(shù)字。分布：是細菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分。 ：IS1 表示IS1因子插入在噬菌體基因組內(nèi)。 復合轉座子