固態(tài)發(fā)酵微生物章

1、第3章 固態(tài)(gti)發(fā)酵微生物3.1 固態(tài)發(fā)酵多菌種培養(yǎng)(piyng)及特點3.2 固體種曲擴(kuò)大培養(yǎng)技術(shù)3.3 固態(tài)分批發(fā)酵微生物的生長 3.4 固態(tài)發(fā)酵菌體量的測定 共四十二頁3.1.2傳統(tǒng)(chuntng)固態(tài)發(fā)酵過程的多菌種混合發(fā)酵3.1.2.1固態(tài)發(fā)酵微生物的多樣性傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的特點是天然接種，多種微生物混合發(fā)酵，很難做到純種發(fā)酵。原因是：許多固態(tài)發(fā)酵是一種開放式或半開放式發(fā)酵體系，在發(fā)酵過程中從各種途徑（最主要是空氣）中帶入大量的微生物。自然環(huán)境、生產(chǎn)原料(yunlio)、水、生產(chǎn)場所、生產(chǎn)用具都會帶入微生物，即使以上批的種曲作為種子人工接種，然而這些種曲也不能保證是純種。 共四十

2、二頁例：茅臺酒釀造微生物的來源：（1）獨特的地理大環(huán)境(hunjng)，對微生物種群的分布也起著關(guān)鍵的作用，這包括： 茅臺酒廠所處的位置及其周邊的環(huán)境、 當(dāng)?shù)氐耐寥捞卣鳎ㄍ寥李愋图昂穸龋?空氣環(huán)流、氣候環(huán)境（溫度、降雨、濕度）、 水環(huán)境；（2）局部環(huán)境，包括： 制曲的場所（頂棚及四周墻壁）、 發(fā)酵酒窯的窯泥、糟醅、黃水、 酒曲和酒醅堆積場所；這些場所常年累月地生產(chǎn)，大量的微生物及其孢子存在于這些場所。（3）釀酒原料：也是微生物載體。 共四十二頁3.1.2.2 多菌種固態(tài)(gti)發(fā)酵的類型野生菌多菌種混合型人工(rngng)接種與野生形多菌種混合型人工接種多菌種混合型：共四十二頁野生菌多菌種

3、混合型：不采用人工接種，參與發(fā)酵的微生物大多是野生型，它們來自生產(chǎn)原料、環(huán)境生產(chǎn)、工具或材料、空氣；在同一酒廠的不同局部(jb)環(huán)境，都存在著種類繁多的不同的微生物菌群。 共四十二頁人工接種與野生形多菌種混合型：當(dāng)人們認(rèn)識到固態(tài)發(fā)酵中參與發(fā)酵的微生物的種類及其變化規(guī)律后，便有意識地分離純化這些微生物，將有益微生物經(jīng)過人工培養(yǎng)，接種到培養(yǎng)物中；生產(chǎn)操作過程中，許多環(huán)節(jié)會帶入野生菌，這些微生物對生產(chǎn)沒有太大的負(fù)面影響，有的甚至對生產(chǎn)有益。故由人工接種微生物和其它野生菌共同發(fā)酵還是被人們認(rèn)可的。由于生長溫度、水分含量和選擇性原料等因素(yn s)，人工接種的微生物具有生長優(yōu)勢，故其它野生菌的帶入客觀

4、上也不會產(chǎn)生太大的負(fù)面影響。 共四十二頁人工接種多菌種混合型：將純培養(yǎng)的多種微生物分別擴(kuò)大培養(yǎng)，先后或同時(tngsh)接種到培養(yǎng)物上，進(jìn)行發(fā)酵。例如，烏衣紅曲，人們認(rèn)識到主要是紅曲菌、黑曲霉和酵母菌是發(fā)揮作用的三種微生物，現(xiàn)已都分離純化到相應(yīng)的菌種，并應(yīng)用于烏衣紅曲的大規(guī)模生產(chǎn)。但要準(zhǔn)確了解發(fā)酵過程中有哪些微生物參與發(fā)酵，哪些是有益的，哪些是有害的；哪些菌種在哪個生產(chǎn)階段發(fā)揮作用，參與發(fā)酵的微生物之間存在什么關(guān)系，通過什么手段來知道微生物的種類和數(shù)量，這正是發(fā)酵微生物生態(tài)學(xué)的研究重點。共四十二頁3.2.1.2 酒曲(jiq)的微生物生態(tài)從微生物的角度來看，酒曲有兩個特點：（1）酒曲，一般是多

5、種微生物共同發(fā)酵，故可從酒曲中分離到大量的微生物；（2）酒曲中微生物的種類及數(shù)量是隨培養(yǎng)過程中不斷變化的。微生物種群的演替，除了微生物的相互關(guān)系外，還有許多外界因素對產(chǎn)生微生物的影響(yngxing)。如發(fā)酵的原料的選用、通風(fēng)、翻（拌）料、發(fā)酵溫度、基質(zhì)的水活度、pH等條件的變化，都對微生物種群及數(shù)量的演替產(chǎn)生重要的影響(yngxing)。共四十二頁酒曲中微生物演替的重要因素-培養(yǎng)溫度在酒曲生產(chǎn)過程中，溫度的變化幅度較大。有些高溫曲的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度一般(ybn)是從低到高，再從高到低的過程，從最初的30左右升溫到最高溫度可達(dá)到65。因而不耐熱的微生物則會大量死亡。另外，霉菌在制曲過程中都可檢測

6、出，但主要是在制曲的前期。檢出的種類包括根霉、青霉、曲霉和紅曲菌。霉菌雖然也不耐熱，但有的霉菌可產(chǎn)生耐熱的孢子，因而可以留存下來。共四十二頁溫度(wnd)是影響微生物演替的重要因素（例）：茅臺酒大曲曲坯入曲房前，曲中的微生物主要以革蘭氏陰性菌為主，數(shù)量達(dá)到105個/g，而革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌種類及數(shù)量較少。進(jìn)入曲房培養(yǎng)后，細(xì)菌開始繁殖，由于微生物的發(fā)酵作用，曲溫逐漸上升，不耐熱的革蘭氏陰性菌因高溫而死亡，而耐熱性好的革蘭氏陽性菌大量繁殖。如產(chǎn)芽孢的Bacillus屬（B. subtilus、B.licheniformis、B. sterthermophilus、 B. thermogluc

7、oseidusuis、 B. amyloliquefacieus）以及Coccus屬、Thermoactinomyces屬。到第一次翻曲時，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到107個/g。在制曲的后期，微生物數(shù)量減少到105-106個/g，但仍以耐高溫的芽孢桿菌為主。革蘭氏陰性菌只占0.5%。在茅臺酒的酒曲中酵母菌在前期的含菌數(shù)在總菌數(shù)中可達(dá)到25%，但當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到65時，酵母菌幾乎全部死亡。這說明制曲培養(yǎng)條件的變化（尤其是培養(yǎng)溫度）是影響菌種演替的重要因素。共四十二頁影響微生物演替因素-酒曲培養(yǎng)基中水分含量 培養(yǎng)前期的酒曲水分含量較高，水活度較大，適合于對水活度要求較高的細(xì)菌的生長，隨著(su zhe)培養(yǎng)過程

8、曲料水分的不斷散發(fā)，曲料中的水活度逐漸下降，因而對水活度要求較高的細(xì)菌和酵母菌死亡增加。而對水活度較低的霉菌和放線菌的孢子在低水活度條件下不易死亡，故其數(shù)量在中期有上升的趨勢。如圖3-2所示。共四十二頁影響微生物演替因素-好氧與厭氧狀態(tài)有些固態(tài)發(fā)酵，通風(fēng)或攪拌是間歇進(jìn)行的，在通后或攪拌的一段時間內(nèi)，氧氣是充足的，但隨著氧氣的被消耗，繼而轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵周而復(fù)始，這對好氧和厭氧微生物的種類及其數(shù)量必將產(chǎn)生影響；也有的固態(tài)發(fā)酵，由于固態(tài)培養(yǎng)基呈疏松狀態(tài)，在發(fā)酵初期，顆粒狀物料中的間隙中含有空氣(kngq)，但由于發(fā)酵主要是厭氧的，故隨著發(fā)酵的進(jìn)行，空隙中的氧氣逐漸被消耗掉，從而轉(zhuǎn)入

9、厭氧發(fā)酵狀態(tài)，從而厭氧微生物占據(jù)優(yōu)勢。即使在同一塊曲內(nèi)，由于物料所處位置的深淺不同，也會呈現(xiàn)不同的好氧或厭氧狀態(tài)。共四十二頁3.4 固體種曲擴(kuò)大培養(yǎng)(piyng)技術(shù)固態(tài)發(fā)酵所需的種子培養(yǎng)，分液體種子培養(yǎng)和固體種子培養(yǎng)兩種方式。 種子的固體培養(yǎng)方法是傳統(tǒng)特色技術(shù)。宋代北山酒經(jīng)中記載“以舊曲末逐個為衣”的人工接種方式，即將挑選當(dāng)年質(zhì)量好的小曲作為種子，用于下一年的生產(chǎn)(shngchn)用種子。這說明，古代人們已經(jīng)創(chuàng)造了固體種子的接種技術(shù)。古代所用的種子，實際上普通方法所生產(chǎn)的，但經(jīng)過比較后認(rèn)為質(zhì)量較好的酒曲。 共四十二頁固體(gt)種子優(yōu)缺點優(yōu)點：可長期保存，有的曲種保存數(shù)年其性能也未下降；可遠(yuǎn)

10、距離攜帶或運輸，量大時運輸成本也低得多；固體種子培養(yǎng)設(shè)施也相對簡單，完全可用常規(guī)的固態(tài)發(fā)酵設(shè)施；使用方便，隨時可用。但固體種子生產(chǎn)過程中，如果條件較差，可能(knng)會染菌，致使種曲含雜菌數(shù)高，這種情況應(yīng)盡量避免。共四十二頁人工純粹擴(kuò)大培養(yǎng)曲種的過程一般分為三步：試管（或茄子瓶）原種(yunzhng)（一級種）三角瓶種子（二級種）曲盤（或種曲機(jī)）培養(yǎng)的種曲（三級種）。在三級種的培養(yǎng)過程中，傳統(tǒng)上采用曲盒、竹匾和金屬盤，置放于消毒較徹底的培養(yǎng)室內(nèi)。這樣三級種的培養(yǎng)并非是嚴(yán)格的純粹培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中仍有許多機(jī)會染菌，操作上也以人工操作為主。共四十二頁現(xiàn)代則越來越多地采用完全(wnqun)密閉，通入

11、無菌空氣的種曲機(jī)作為三級種的培養(yǎng)裝置，淺盤式或攪拌式固態(tài)發(fā)酵罐為主要形式。 共四十二頁共四十二頁紅曲曲(q q)種的培養(yǎng)試管斜面米飯三角瓶培養(yǎng)成熟曲種低溫烘干或曬干一級種一級種無菌水浸泡磨漿制曲種醬（曲種水醋酸=1110.2）曲種醬接種（曲種醬米=6.2100）二級種曲窯培養(yǎng)（曲料裝袋，升溫培養(yǎng)，45-50，20 h左右）攤薄培養(yǎng)裝框浸水（加醋酸，大米質(zhì)量的0.2%）瀝水(lshu)堆積培養(yǎng)，36攤薄培養(yǎng)浸二水堆積培養(yǎng)23 h，34浸三水瀝干堆積培養(yǎng)翻拌低溫烘干二級種。共四十二頁 共四十二頁3.4.3 厚層通風(fēng)(tng fng)制種曲一些規(guī)模較大或?qū)ｉT生產(chǎn)種曲的企業(yè)，采用厚層通風(fēng)法制種曲。和成

12、曲培養(yǎng)方法相同(xin tn)。但目的是培養(yǎng)孢子。故培養(yǎng)基成分及條件有差別。共四十二頁“曲精”這是商品化供應(yīng)的“種曲”，也稱為“曲種”。國內(nèi)許多中小型酒廠、醬油廠、豆醬廠、面醬廠、醋廠和腐乳廠不具備自行配備種曲的培養(yǎng)條件，“曲精”的生產(chǎn)(shngchn)和供應(yīng)隨之興旺起來。目前許多供應(yīng)商可供應(yīng)各種類型的專用種曲。如醬油專用種曲、豆醬專用種曲、豆豉專用種曲、面醬專用種曲、腐乳專用種曲、白酒或黃酒專用種曲及釀醋專用種曲。曲精是米曲霉在開放的條件下生產(chǎn)的種曲孢子集合體，而并非是嚴(yán)格無菌操作條件下生產(chǎn)的，故曲精中含有一定的雜菌，因而曲精不能作為三角瓶的種曲，它只能作為種曲用于生產(chǎn)制曲。 共四十二頁3.

13、3 固態(tài)(gti)分批發(fā)酵微生物的生長菌體量的表示方法：由于研究者的習(xí)慣(xgun)及研究重點不同，霉菌生長及菌體量的表示方法有多種，很難統(tǒng)一。下面是一些研究者表示霉菌菌體量的方法：共四十二頁菌體量的表示(biosh)方法菌絲的長度（mm）：培養(yǎng)皿上霉菌(mjn)菌絲長度或菌絲體顯微鏡攝影結(jié)果都可用于表示菌體量。菌落的面積濃度（kg菌體/m2）：當(dāng)以培養(yǎng)皿培養(yǎng)菌體時，由于各培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基體積相同，故可簡化為用面積表示。質(zhì)量體積濃度（kg菌體/m3培養(yǎng)基質(zhì)）：在一定體積的培養(yǎng)基測得其菌體質(zhì)量。共四十二頁菌體量的表示(biosh)方法質(zhì)量比濃度（kg菌體/kg基質(zhì)）：菌體和培養(yǎng)基質(zhì)均以質(zhì)量表示。而

14、根據(jù)培養(yǎng)基質(zhì)的基準(zhǔn)，又分為濕重為基準(zhǔn)，干基為基準(zhǔn)的兩種表示方法。根據(jù)培養(yǎng)基的初始狀態(tài)和瞬時狀態(tài)，還有菌體的絕對(judu)濃度和相對濃度的表示方法。共四十二頁 菌體的絕對濃度CXA：即菌體量量（X）和培養(yǎng)物的初始質(zhì)量（W0）比，定義為：菌體的相對(xingdu)濃度CXR：菌體質(zhì)量（X）和取樣時培養(yǎng)物的質(zhì)量（W）比，定義為：共四十二頁菌體生長(shngzhng)動力學(xué)模型 總體(zngt)上分為4種類型：直線關(guān)系指數(shù)關(guān)系對數(shù)關(guān)系衰減關(guān)系共四十二頁 菌體生長動力學(xué)模型直線關(guān)系指數(shù)關(guān)系對數(shù)關(guān)系衰減關(guān)系微分方程積分方程共四十二頁 共四十二頁菌體死亡(swng)的動力學(xué)模型在固態(tài)發(fā)酵(f jio)過程

15、中，當(dāng)營養(yǎng)條件及生長條件符合時，菌體就不斷生長，但隨著培養(yǎng)時間菌體的死亡也是不可避免的。在菌體生長的衰亡期，菌體的生長和死亡實際上同時進(jìn)行。菌體的比生長速率是這兩者之差?？偟木w量包括活菌體和死菌體。假定菌體死亡是按照一級方程進(jìn)行，則可得到描述菌體的死亡方程：共四十二頁菌體的凈比生長(shngzhng)速率： 共四十二頁3.4 固態(tài)(gti)發(fā)酵菌體量的測定3.4.1固態(tài)發(fā)酵生物量的特點固態(tài)發(fā)酵過程中，如果所采用的微生物是單細(xì)胞的細(xì)菌和酵母菌，可以將微生物和固態(tài)基質(zhì)分離(fnl)開來，故直接檢測生物量也是可行的；但若所采用的微生物是絲狀真菌，由于菌絲體會滲透到固態(tài)基質(zhì)之中，與基質(zhì)緊密纏結(jié)在一起

16、，不易將微生物與固態(tài)基質(zhì)定量地完全分離(fnl)，故直接檢測菌體生物量很難。一般采用間接法檢測生物量。共四十二頁而對于食用菌或藥用真菌的培養(yǎng)，由于其菌體的子實體主要部分是直接生長在空氣中的，且其形體(xngt)較大，直接測定其菌體量完全可行。表示菌體量的生長可稱其重量或測定其線性長度。固態(tài)發(fā)酵生物量的檢測方法主要有三種：直接檢測生物量；通過細(xì)胞組分的檢測間接檢測生物量；通過生物體的代謝活動間接檢測生物量。 共四十二頁3.5.2 細(xì)胞(xbo)生物量直接檢測法先分離(fnl)，再檢測計數(shù)法稱重法共四十二頁3.5.3細(xì)胞(xbo)生物量間接檢測法3.5.3.1通過(tnggu)細(xì)胞組分的檢測間接檢

17、測生物量3.5.3.2通過核酸的檢測間接檢測生物量3.5.3.3通過葡萄糖胺的檢測間接檢測生物量3.5.3.4 通過測定含氮量間接檢測生物量3.5.3.5通過菌體代謝活性的檢測間接檢測生物量共四十二頁3.5.3.1通過細(xì)胞組分的檢測(jin c)間接檢測(jin c)生物量可用一些間接的方法檢測菌體的組成物質(zhì)，從而估算固態(tài)發(fā)酵微生物菌體生物量。這些組成物質(zhì)包括：葡糖胺（glucosamin）、麥角甾醇（ergosterol）、核酸、總糖、蛋白質(zhì)。微生物細(xì)胞壁或細(xì)胞膜具有某些特征性的化合物，它們是在微生物生長過程所形成的，并且具有明顯的光譜特征。例如(lr)，真菌的細(xì)胞壁中葡萄糖胺（glucos

18、amine）的含量豐富，真菌細(xì)胞膜中的甾醇含量豐富。這些物質(zhì)都可用分光光度計法或HPLC法來測定。共四十二頁要測定生物量，必須首先建立這些組成分與菌體干物質(zhì)含量的關(guān)系式。純菌體的干物質(zhì)，可用膜培養(yǎng)法、瓊脂平板培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法獲得。然后，測定菌體中的葡糖胺、麥角甾醇等成分(chng fn)的含量，建立其含量與菌體量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時應(yīng)建立葡糖胺、麥角甾醇等成分(chng fn)的分析方法。共四十二頁3.5.3.2通過核酸(h sun)的檢測間接檢測生物量核酸在細(xì)胞中的含量(hnling)十分穩(wěn)定。在代謝上也較為穩(wěn)定，不易被分解代謝。理論上講，核酸的含量(hnling)與生物量具有較好的線性關(guān)

19、系。每個細(xì)菌的DNA含量(hnling)平均為8.410-5ng。將一定體積的細(xì)菌懸浮液離心，從細(xì)菌中提取DNA，求得DNA含量(hnling)，則可計算出這一定體積的細(xì)菌懸浮液所含的細(xì)菌總數(shù)。共四十二頁純菌體中核酸的提取及測定：精密稱取0.1g純菌體，加入5%的三氯乙酸溶液25mL，于80水浴中放置25min，其間不斷進(jìn)行攪拌，取出后置于冰浴中冷卻，然后在8000r/m，4離心15min，稀釋5倍，以5%三氯乙酸作空白對照，于260nm處測定OD值。核酸濃度(nngd)C可按照下式計算：C=50 OD260 (g/mL)取不同的菌體量，測其核酸含量，作菌體量與核酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。共四十二頁3.5.3.3通過(tnggu)葡萄糖胺的檢測間接檢測生物量用葡萄糖胺的含量間接表達(dá)(biod)菌體干重是許多研究者所采用的方法。葡萄糖胺是幾丁聚糖的組成分之一。共四十二頁3.5.3.3通過葡萄糖胺的檢測間接檢測生物量用葡萄糖胺的含量間接表達(dá)菌體干重是許多研究者所采用(ciyng)的方法。葡萄糖胺是幾丁聚糖的組成