納米級(jí)細(xì)胞型組織工程骨的構(gòu)建及其血管化的實(shí)驗(yàn)研究

1、納米級(jí)細(xì)胞型組織工程骨的構(gòu)建及其血管化的實(shí)驗(yàn)研究骨組織工程的興起和快速發(fā)展為治療骨缺損提供了新的思路和手段。 在種子細(xì)胞和細(xì)胞載體材料的研究取得了一定的成果的基礎(chǔ)上， 已經(jīng)可以在體外成功的將種子細(xì)胞復(fù)合在載體材料上培養(yǎng)，構(gòu)建出細(xì)胞型組織工程人工骨。并應(yīng)用在體外構(gòu)建出的細(xì)胞型組織工程人工骨進(jìn)行修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。研究發(fā)現(xiàn)，組織工程骨也面臨迅速血管化的關(guān)鍵問題。同其它類型移植骨一樣， 充分的血液供應(yīng)是保證組織工程化人工骨體內(nèi)存活的決定性因素。 如何在構(gòu)建組織工程人工骨的同時(shí)重建其血液供應(yīng)成為骨組織工程從體外研究過度到體內(nèi)研究，從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用過渡的關(guān)鍵性問題。本課題針對(duì)組織工程的構(gòu)建和血管化

2、做了以下五項(xiàng)研究： 一、 骨組織工程種子細(xì)胞骨髓來源成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及成骨特性觀察 目的 探索兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells BMSCs) 在體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的成骨特性， 為骨組織工程提供理想的種子細(xì)胞。 方法 抽取兔骨髓， 通過離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)30 天，觀察并檢測成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果BMSCs可在成骨條件培養(yǎng)液下誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定堿性磷酸酶和礦化結(jié)節(jié)染色陽性。 結(jié)論 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，有希望成為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床。組織工程骨血管化種子細(xì)胞兔腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及其細(xì)胞表型的初步研究 目

3、的 探索腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法， 并對(duì)其進(jìn)行鑒定和表型研究， 擬為骨組織工程血管化提供理想的種子細(xì)胞。 方法 采 用三步梯度篩網(wǎng)法， 先獲得較高純度的腎血管球， 再應(yīng)用腎血管球外植法體外培 養(yǎng)腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)一步對(duì)腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組化法的即因子相關(guān)抗原鑒定，用透射電鏡觀察細(xì)胞漿Weibel-Palade 小體， 以及采用間接免疫熒光法檢測CD31、 CD34及CD44表達(dá)。納米級(jí)細(xì)胞型組織1_程骨的構(gòu)建及其血管化的實(shí)驗(yàn)研究中文提要結(jié)果體外培養(yǎng)出純度很高的血管內(nèi)皮細(xì)胞并培養(yǎng)了 23 代。止匕外，免疫組化顯示姍因子相關(guān)抗原陽性，電鏡下觀察到W比ibel Palade 小體，以及

4、間接免疫熒光檢出 CD31 CD34表達(dá)陽T而CD44K性。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)方法可成功培養(yǎng)出腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞，且后者表達(dá) CD31 CD34細(xì)！泡表型。成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞體外協(xié)同培養(yǎng)的生物學(xué)特性觀察 目的通過血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞體外協(xié)同培養(yǎng)， 探討兩種細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)時(shí)生物學(xué)特性的相互影響。 方法用兔骨髓來源的成骨細(xì)胞和兔腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞采取直接和間接協(xié)同培養(yǎng)的方法倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞一般形態(tài)， 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較增殖能力，檢測堿性磷酸酶（ALP）活性，研究成骨細(xì)胞成骨能力的改變。結(jié)果在直接和間接兩種協(xié)同培養(yǎng)條件下，BMSC細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)與兔腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的相容性， 血管內(nèi)皮細(xì)

5、胞可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化， 并促進(jìn)堿性磷酸酶（ALP） 的分泌， 同時(shí)提高成骨細(xì)胞的成骨能力 ;成骨細(xì)胞也能J 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和生長。 結(jié)論體外協(xié)同培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞，兩種細(xì)胞能互相促進(jìn)分化和增殖，并提高功能表達(dá)。納米級(jí)細(xì)胞型組織工程人工骨的構(gòu)建即納米相輕基琪灰石膠原復(fù)合材料與人骨位基質(zhì)干細(xì)胞體外相容性的研究 目的探討納米相輕基磷灰石膠原復(fù)合材料（nano HAP/c ollagen , NHAc而人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（rBMSC）的相容性， 為體外構(gòu)建納米級(jí)細(xì)胞型組織工程人工骨提供依據(jù)。 方法將人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與納米相經(jīng)基磷灰石膠原復(fù)合材料體外復(fù)合培養(yǎng)， 進(jìn)行形態(tài)學(xué)和功能測4

6、定。結(jié)果骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能在納米相輕基磷灰石膠原復(fù)合材料上良好地粘附、 增殖、 生長。 細(xì)胞的活性和堿性磷酸酶活性未受到納米相輕基磷灰石膠原復(fù)合材料的影響。結(jié)論納米相輕基磷灰石膠原復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性， 可作為骨組織工程理想的骨替代材料。 納米級(jí)細(xì)胞型組織!_ 程骨的構(gòu)建及其血管化的實(shí)驗(yàn)研究中文提要五、 血管化納米級(jí)細(xì)胞型組織工程骨修復(fù)骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。目的探討血管化納米級(jí)細(xì)胞型組織工程人_骨修復(fù)骨缺損過程中血管的生成情祝，以及新生血. 管和成骨的關(guān)系，為臨床治療骨缺損提供理想的人工骨。 方法應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞+納米級(jí)細(xì)胞型組織工程骨的方式將人工骨血管化， 然后植入兔體內(nèi)修復(fù)撓骨骨缺損， 通過墨汁灌注法， 組織學(xué)切片以及X 線檢測，觀察新生血管的情況和骨愈合的情況。并以未血管化的納米級(jí)細(xì)胞型組織工程人工骨作為對(duì)照組。 結(jié)果 l ，觀察到血管化人工骨組的新生血管比對(duì)照組生成的要多。2，兩組人工骨均能有效的修復(fù)骨缺損，但血管化人工