western blot 的原理與操作方法(詳細(xì))

1、WesternBlot原理和操作方法(詳細(xì))工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一，電泳是指帶電粒子在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象根據(jù)所采用的支持物不同，有瓊脂糖凝膠電泳，淀粉凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳等其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用，樣品用量少(l-100“g分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品，凝膠機(jī)械強(qiáng)度大，重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用SDS是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分離蛋白質(zhì)，主要依據(jù)

2、其分子量和電荷的差異，而SDS(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異，因?yàn)镾DS的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT)，其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化，蛋

3、白質(zhì)也完全變性和解聚，并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計(jì)，消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度，使加樣

4、時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的，因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算：T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%其中：玄=雙體(bis)的重量；b=單體(arc)的重量；m=溶液的體積(ml)當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn)，以便選擇理想的膠濃度如果蛋白質(zhì)的分子量已知，可參考下表選擇所需凝膠濃度：蛋白質(zhì)分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度()5x1052-5分

5、離膠：電泳凝膠濃度試劑10%12%15%10%12%15%H2O(ml)4.03.32.35.94.93.430%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)3.34.05.05.06.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.810%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.1510%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15TEMED(yl)444666總體積(ml)1015濃縮膠試劑濃度(5%)H2O(ml)4230%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)10.51.0mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)10.

6、510%SDS(yl)804010%AP(yl)6030TEMED(yl)84總體積(ml)63蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是WesternBlotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適

7、的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80C中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器二：需要的溶液：裂解液Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450卩1裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450卩1裂解液，細(xì)胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S,間歇時(shí)間為10S，功率為100

8、-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4C25000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100C水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2）組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中

9、，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品

10、制備是WesternBlotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80C中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器二

11、：需要的溶液：裂解液Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450卩1裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450卩1裂解液，細(xì)胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S,間歇時(shí)間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4C25000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S

12、，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100C水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2）組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣

13、品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）附：一:裂解液的制備：組織裂解液（全細(xì)胞蛋提?。?：Tris-HCL50mmoL/LPH7.42:Nacl150mmoL/L3:去氧膽酸鈉0.25%4：N

14、P-40或Triton-x-1001%5:EDTA1mmoL/L6：PMSF1mmoL/L7:Aprotininlyg/ml8:leupeptinlyg/ml9:pepstainlyg/ml其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。細(xì)胞裂解液：1：NP-40裂解體系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-10050mmoL/LTris（PH8.0）2：RIPA裂解體系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脫氧膽酸鈉0.1%SDS50mmoL/LTris（ph8.0）二:Laemmli樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液）50m

15、moL/LTris-HCL（PH8.0）100mmoL/LDTT2%SDS0.1%溴酚藍(lán)10%甘油此液可以配置成不同的儲(chǔ)存液，根據(jù)蛋白濃度而定，40C長期保存，用時(shí)臨時(shí)與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時(shí)加入，以防降解。蛋白質(zhì)定量Bradford法：檢測原理:Bradford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)，特殊氨基酸結(jié)合，由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測.該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不使用于小分子堿性多肽的定量，如核糖核酸酶或溶菌酶，去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果，如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml

16、95%乙醇，加入100ml濃磷酸;然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4C至少6個(gè)月保持穩(wěn)定.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)，如果待測樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20yg-150聘/100卩1之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將待測樣本溶于100卩1緩沖溶液中，該緩沖溶液相同（最好用PBS）按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀，過濾除去.每個(gè)樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液，作用5-30分鐘，燃料與蛋白結(jié)合，將由紅色變?yōu)樘m色，在595nm波長下測定其吸光度，注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測

17、樣品的濃度Lowry法：檢測原理：是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測.首先，將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1gCuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液，儲(chǔ)存于冰箱中，可穩(wěn)定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/lNaOH溶液混合，室溫下儲(chǔ)藏，可穩(wěn)定保存2周，標(biāo)明為試劑A按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合，室溫下儲(chǔ)存于琥珀色試劑瓶中，可穩(wěn)定保存1個(gè)

18、月，表明為時(shí)機(jī)B用蒸餾水將樣本(5-100聘)稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,12.5yg/ml,4個(gè)濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.每個(gè)蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.加入0.5ml試劑B并立即混合，在室溫下孵育30分鐘.在750nm光波長下測定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)的濃度.紫外分光光度法：檢測原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長下有最大吸光率，最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.純化蛋白質(zhì)濃度的測定:在280nm波長下讀取與適當(dāng)對(duì)照相比較的吸光值.對(duì)于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其濃度，對(duì)其他蛋白質(zhì)粗略地估計(jì):1單位吸光值相當(dāng)于1mg/m

19、l蛋白質(zhì)A280(1mg/ml)IgG1.35IgM1.2BSA0.7含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測定：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)SDS設(shè)備和材料電泳裝置(垂直板電泳槽)為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。電泳儀(電源)為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。振蕩器試劑丙烯酰胺(電泳級(jí))N,N-甲叉雙丙烯酰胺(bis)SDSTEMEDTris過硫酸銨a巰基乙醇或DTT甘油甘氨酸溴酚藍(lán)（11）鹽酸3）聚膠前準(zhǔn)備：配制凝膠儲(chǔ)液：T%=30%C%=1%arc:bis=29:1

20、過濾后4C避光保存。配制濃縮膠緩沖液：1.0mol/LTrisHClPh6.8,過濾后4C避光保存。配制分離膠緩沖液：1.5mol/LTrisHClPh8.8,過濾后4C避光保存。配制10%SDS配制10%過硫酸銨（AP）TEMED原溶液電泳緩沖液（5x）：Tris15g+甘氨酸72g+SDS5g+H2O至1L,臨用時(shí)稀釋5倍至1xSDS電泳緩沖液加入電泳槽中。4）制膠：制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間，最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時(shí)間為15-20分鐘（并不是此時(shí)已凝聚完全）。對(duì)濃縮膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合，可以通過調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量

21、來控制，因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時(shí)可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合，總之，要掌握一個(gè)原則：即用盡量少的催化劑在最佳時(shí)間聚合。按比例配制分離膠，輕緩地?fù)u動(dòng)溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置90min。同前按比例配制濃縮膠，但搖動(dòng)溶液時(shí)不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制90min以上以保證完全聚合。5）預(yù)電泳：將聚合好的凝

22、膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。6）加樣：預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。7）電泳：加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在連續(xù)系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)，應(yīng)采用恒壓的模式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V,分離膠120V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停

23、止電泳。8）染色和脫色電泳完畢需通過染色和脫色評(píng)定其結(jié)果的優(yōu)劣對(duì)凝膠中分離成不同條帶的蛋白進(jìn)行檢測此外，根據(jù)不同的研究目的，也可將凝膠電印跡考馬斯亮藍(lán)染色：將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液，以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩，直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止，一般5-6小時(shí)或者4C過夜;然后傾去染色液，用脫色液洗滌震蕩，其間要不斷換脫色液，直至脫色液顏色稍清亮，凝膠背景清楚為止.染色液配制：90ml甲醇和H20混合溶液（甲醇:水=1:1，V/V）和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).脫色液的配制：90mL（甲醇）:H20（1:1V/V）和1

24、0ml冰乙酸溶液.附：一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇凝膠電泳中一個(gè)關(guān)鍵的指示系統(tǒng)，即蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（MolecularWeightMarker），電泳的分離效率,轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動(dòng)情況等，皆需通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品有：BlueRangerTMprestainedproteinMolecularWeightMarkerMixTrichromRangerTMprestainedproteinMolecularWeightMarkerMix以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：prod#26681;prod#26691;該標(biāo)準(zhǔn)蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷

25、移，各種分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動(dòng)情況，當(dāng)相對(duì)于目的蛋白大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與相鄰兩條標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到所需分辨距離時(shí)，即可停止電泳，取出凝膠做進(jìn)一步的轉(zhuǎn)膜工作。ChemiluminescentBlueRangerRperoxidase-LabledproteinMolecularWeightMarkerMix以上也為PIERCE產(chǎn)品，貨號(hào)為:prod#26651，該標(biāo)準(zhǔn)蛋白同上也具有以上作用外，同時(shí)在使用化學(xué)發(fā)光時(shí)，和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后，在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。BlotinylatedSDSMolecularWeight

26、MarkerMix以上為Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為B2787,作用效果同二、對(duì)照的設(shè)置一般需要設(shè)立：內(nèi)參照，提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白陽性對(duì)照，即肯定可以表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞,同時(shí)可以提示你一抗的質(zhì)量陰性對(duì)照：即肯定不會(huì)表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)你的需要選擇免疫印跡蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS后，分離為不同條帶，其中含有能與特異性抗體（或McAb）相應(yīng)的待檢測的蛋白質(zhì)（抗原蛋白），將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過程稱為blotting，以利于隨后的檢測能夠的進(jìn)行，隨后，將NC膜與抗血清一起孵育，使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合（特異大蛋白

27、條帶），再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng)，即檢測樣品的待測抗原并可對(duì)其定一、設(shè)備和材料轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀（電源）震蕩器冰箱濾紙NC膜膠片暗室二、試劑封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T第一抗體（Abl）第二抗體（標(biāo)記的Ab2）底物以及顯色指示劑漂洗液（TBS-T）轉(zhuǎn)印緩沖液抗體稀釋液麗春紅S顯影液定影液三、試劑的配制封閉液:5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T漂洗液（TBS-T）:0.01MTBS-T為Tris1.21g+NaC15.84g+800mlH2O用HC1調(diào)節(jié)PH到7.5，假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml轉(zhuǎn)印緩沖液：同5xSDS電泳緩沖液，不含SDS，如

28、果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇，不加甲醇也可以Tris15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,般不需調(diào)節(jié)PH值，用時(shí)稀釋5倍到lx轉(zhuǎn)印緩沖液.顯影液：H2O-750ml米土爾-3g無水亞硫酸鈉100g對(duì)苯二酚3g溴化鉀3g無水碳酸鈉：先加5gPH10.0不夠時(shí)再加5g注：以上配定加H2o定容至1000ml定影液：起始水溫：60CH2o700ml硫代硫酸鈉：240g無水亞硫酸鈉：25g冰醋酸：48ml注：加H2o至1000ml四、電印跡蛋白質(zhì)經(jīng)SDS分離后，必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點(diǎn)，常用的支持

29、物有：硝酸纖維膜（NC膜）或PVDF膜。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。一.半干式電轉(zhuǎn)印Tris/甘氨酸-SDS結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部棄去，下部以分子量標(biāo)準(zhǔn)最小分子帶下一點(diǎn)全部劃去，取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自然分開，邊推邊進(jìn),反復(fù)多次注水，直至凝膠從玻璃板上滑落下來。將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤5-10min.按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半干槽中。每層之間的氣泡要全部

30、去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動(dòng)去除氣泡，然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點(diǎn)，以防電流直接從沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。Tris/甘氨酸-SDS結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC膜

31、應(yīng)對(duì)電泳槽的正極。五、印跡膜上總蛋白的染色在確定印跡中是否存在總蛋白之前，通過對(duì)硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功，同時(shí)，該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性.麗春紅S印跡膜染色法：麗春紅S適用于酸性水溶液，染色但是不持久，在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù)，麗春紅S帶負(fù)電荷,可以與帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合，同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合，從而形成紅色條帶1）麗春紅溶液的配制：儲(chǔ)存液（10 x）：0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸，加入H2O定容至100m

32、l,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液.2）操作步驟轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中，并在室溫下攪動(dòng)5-10分鐘將膜放入PBS洗數(shù)次，每次1-2分鐘，并且更換PBS根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記至此膜可以用于封閉和加入抗體六、膜的封閉在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20,20%BSA,10%馬血清以及5%No-fatmilk等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20

33、%BSA效果較好，其次是5%N-fatmilk.封閉過程：1）洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min，以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。2）取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5%No-fatmilk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉2h,也可在4度過夜。3）用1xTBS-T，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.七、抗體雜交抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢測，標(biāo)記Ab2物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。雜交過程：1）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的Ab1濃度為lug/ml，封口，4C孵育過夜或室溫（22-25C）搖動(dòng)孵育2h.2）液洗膜3次xlOmin3）標(biāo)記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫lh,洗膜3x10min八、檢測根據(jù)標(biāo)記Ab2的標(biāo)記物不同，其雜交的結(jié)果檢測方法也不同,較常用的檢測系統(tǒng)有HRP標(biāo)記Ab2的的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）和DAB檢測系統(tǒng).1）辣根過氧化物酶-DAB法：DAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.顯色:將適量DAB顯色液平鋪在Ab2雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察，可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯