楊樹(shù)EBP1基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

1、楊樹(shù) EBP1 基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建收稿日期： 2014-05-25 基金項(xiàng)目：天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金 （編號(hào)： 20120619 ） ; 天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)： 14JCQNJC1500 ） 0 。通信作者： 閻國(guó)榮，博士，教授，主要從事植物資源學(xué)研究。 E-mail ： yanguorongeyou 。自然界中植物種類繁多、 形態(tài)各異， 其中器官大小是造成植 物形 態(tài)多樣性的主要因素之一。 不同植物間器官大小可能存在顯 著差異， 但 就同一物種內(nèi)相同基因型的不同植物個(gè)體而言， 在相 同的生長(zhǎng)環(huán)境下它 們的器官大小基本一致， 表明植物各器官最終 大小的形成受到嚴(yán)格的

2、遺 傳調(diào)控 1 。因此，近年來(lái)從不同植物 中挖掘參與器官大小發(fā)育調(diào)控的 基因或轉(zhuǎn)錄因子并揭示其調(diào)控 機(jī)制的研究備受關(guān)注， 并已在擬南芥和一 些農(nóng)作物如水稻、 玉米、 油菜、番茄、馬鈴薯等中取得了長(zhǎng)足的研究進(jìn) 展 1-2 。有研究 發(fā)現(xiàn)，在外界生長(zhǎng)條件一致的情況下， 植物各器官的 最終大小在 細(xì)胞水平上受細(xì)胞數(shù)量和大小的協(xié)同控制 3 。因此， 分離、 克 隆參與調(diào)控植物細(xì)胞數(shù)量和大小的基因并闡釋其功能是揭示植 物器官 大小發(fā)育控制機(jī)制的關(guān)鍵。 目前， 在擬南芥等草本植物中 已有多個(gè)相 關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被成功分離和克隆。有研究表明，AINTEGUMEN（ TAANT ）4 、ANGUSTIFO

3、LIA （3 AN3 ）5 、GROWTH-REGULATING FACT （OARtG5 RF5 ） 5 、 GRF-INTERACTING FACTO （R GIF ） 6-7 、JAGGE （DJAG ）8 、STRUWWELPE （ T ESRWP ） 9 、SWELLMAP （1SMP1 ）10 、KLUH （KLU ）11 、EBP112 及Auxin-Regulated Geneinvolved in Organ Size（ ARGO ） S13-14等主要通過(guò)正向調(diào)控細(xì)胞增殖能力控制器官內(nèi)細(xì)胞數(shù)量， 進(jìn)而影 響器官 大小。 這些基因的異位過(guò)表達(dá)可通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞增殖時(shí)間導(dǎo) 致植物器

4、官變 大，而突變則會(huì)導(dǎo)致植株器官整體變小。另外，還 有一些基因通過(guò)調(diào)控 細(xì)胞大小來(lái)影響器官的大小， 如 ARGOS-LIKE （ARL ）15 、 ROTUNDIFOLIA （3 ROT3 ）16 、AtGRF1/217 、 BIGPETAL18 、 AtTOR19 、ORGANSIZE RELATED （1 OSR1 ）20 等，其中擬南芥中 EBP1 被證實(shí)對(duì)植物細(xì)胞數(shù)量和大小均能發(fā)揮 正向調(diào)控作用 12 。擬南芥 EBP1 是和人類的 ErbB-3 表皮生長(zhǎng)因 子受體結(jié)合蛋白同源的一個(gè)基因， 與核糖體的生物合成相關(guān)， 該 基因在進(jìn)化上具有較高的保守性。 目前 除在擬南芥外， 在沙冬青 和

5、馬鈴薯中也有該基因序列的相關(guān)報(bào)道， 但 該基因在其他植物中 的功能仍未知， 特別是在木本植物中， 尚未有該 基因的相關(guān)報(bào)道。 因此，本研究對(duì)楊樹(shù)中 EBP1 基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其 表達(dá)載體進(jìn) 行構(gòu)建。相關(guān)研究對(duì)進(jìn)一步揭示楊樹(shù) EBP1 的功能具有重要 意義， 同時(shí)對(duì)采用基因工程等手段提高林木產(chǎn)量和品質(zhì)具有潛在的應(yīng) 用 價(jià)值。1 材料與方法試驗(yàn)材料黑楊（ Populus nigra ），種植于南開(kāi)大學(xué)校園內(nèi) ;pEASY-T1 載體，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)XX 公司；植物表達(dá)載體 PBI121 、 農(nóng)桿菌 LBA4404, 均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。方法黑楊總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 采用改良的 C

6、TABt 提取黑 楊葉片 總 RNA 以 Oligo dT （ 18 ）為逆轉(zhuǎn)錄引物，在 M-MLV 作 用下逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 。引物設(shè)計(jì)及同源克隆 以擬南芥及其他草本植物中已 經(jīng)報(bào)道 的 EBP1 基因 DNA 及 cDNA 序列為種子序列， 利用 Blast 序 列比對(duì)軟件 搜索楊樹(shù)基因組及 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得楊樹(shù)中候選 EBP1 基因序列。隨后 根據(jù)篩選、獲得的楊樹(shù)中 EBP1 候選序列設(shè)計(jì)引 物，進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。進(jìn)一步對(duì) NCBI 數(shù) 據(jù)庫(kù)中 收集的楊樹(shù) EBP1 相關(guān) EST 序列進(jìn)行分析，結(jié)合測(cè)序結(jié)果， 對(duì)楊樹(shù)中 EBP1 基因全長(zhǎng) cDNA 序列進(jìn)行克隆及

7、序列分析。楊樹(shù) EBP1 表達(dá)載體構(gòu)建及分子鑒定 根據(jù)已獲得的 楊樹(shù) EBP1 候選基因全長(zhǎng) cDNA 序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng) cDNA 擴(kuò)增 引物，對(duì) EBP1 全長(zhǎng) cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增及 T-A 克隆。挑取 含有楊樹(shù) EBP1 全長(zhǎng) cDNA 的陽(yáng)性克隆，放大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通 過(guò)雙酶切獲得帶有黏 性末端的 EBP1 全長(zhǎng) cDNA 序列。進(jìn)而與經(jīng)過(guò) 相同雙酶切的植物表達(dá)載 體 PBI121 采用 T4 連接酶進(jìn)行連接， 最 終獲得 EBP1 重組表達(dá)載體。 將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞，在 LB+ 卡那霉素（ Kan ）板上篩 選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液 PCR 和 酶切驗(yàn)證， 進(jìn)而

8、獲得插入方向和序列完全 正確的陽(yáng)性克隆。 隨后并采用凍將該陽(yáng)性克隆放大培養(yǎng)， 采用質(zhì)粒提取試劑提取重組質(zhì)粒， 融法將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌 LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，在 YEB+ 鏈霉素（ str ） +利福平（ Rif ）板上篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液 PCR 驗(yàn)證。 2 結(jié)果與分析楊樹(shù) EBP1 基因的克隆根據(jù)序列同源性分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物對(duì) EBP1-1F ：5 -ATGTCGTCAGACGACGA G 和 EBP1-1R :5 -TTCCTAGACGGCGGTGG- 以黑楊 cDNA 為模板對(duì)楊樹(shù)中 EBP1 候 選基因進(jìn)行克隆。擴(kuò)增結(jié)果顯示，黑楊中EBP1 候選基因全長(zhǎng)cDNA 約為 1.2

9、 kb （圖 1 ）。將獲得的 cDNA 通過(guò) T-A 克隆方法，連入 pEASY-T 載體，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，楊 樹(shù)中 EBP1 基因全長(zhǎng) cDNA 序列長(zhǎng)度為 1 215 bp ，將其命名為 PtEBP1 。楊樹(shù) PtEBP1 的生物信息學(xué)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)獲得的 PtEBP1 進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析。同源性比對(duì)結(jié)果顯示， PtEBP1 與已報(bào)道的沙冬青和馬鈴薯 EBP1 基因 具有較高的同源性，其中與沙冬青EBP1 蛋白序列的同源性為 89%與馬鈴薯 EBP1 蛋白同源性為 87% （圖 2）。保守結(jié)構(gòu)域 分析 結(jié)果顯示 PtEBP1 含有 1 個(gè) PA2G4-lik

10、e-domain ，這個(gè)結(jié)構(gòu) 域?qū)儆?APP_MetAP 超家族（圖 3）。由此推測(cè)楊樹(shù) PtEBP1 基因應(yīng)屬于轉(zhuǎn)錄 因子 APP_MetAP 超家族的一個(gè)成員。PtEBP1 表達(dá)載體的構(gòu)建為對(duì) PtEBPI 的功能及作用機(jī)制進(jìn)行探究，本試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)PtEBP1 植物表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。 首先通過(guò)對(duì) PtEBP1 的序列分析，結(jié)合pBI121載體酶切位點(diǎn)信息，確定選用Xbal和Sacl對(duì)PBI121 載體進(jìn)行切割；隨后設(shè)計(jì)帶有 Xbal 和 SacI 切割序列的 引物 PtEBPI-F : 5 -TCTAGAATGTCGTCAGACGACG AGA- PtEBPI-R: 5 A -GAGCTC

11、CTAGACGGCGGT 將擴(kuò)增序列通過(guò) T-A 克隆方法導(dǎo)入 pEASY-T1 質(zhì)粒，挑取陽(yáng)性克 隆并提 取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行 Xbal 和 SacI 雙酶切消化處理后， 獲得帶有雙酶切位點(diǎn)的目的片段，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的 pBI121 的載體進(jìn)行連接（圖 4）。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素抗 性的 LB 平板上篩選陽(yáng)性克隆， PCR 僉測(cè)顯示陽(yáng)性重組 克隆中含有 1.2 kb 的目的片段；陽(yáng)性重組克隆進(jìn)一步經(jīng)過(guò) Xbal 和 SacI 雙酶切后也能產(chǎn)生 1.2 kb 的目的片段 （圖 5）。這表明楊樹(shù) EBP1 基因已成功構(gòu)建入植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體 pBI121 中。農(nóng)桿菌

12、 LBA4404 中表達(dá)載體的菌液 PCF 鑒定采用凍融法將已 構(gòu)建好的表達(dá)載體 pBI121-PtEBP1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（ LBA4404 ）感受態(tài)細(xì) 胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。 隨機(jī)挑取 4 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液 PCR， PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物均為 1.2 kb （圖 6），證明表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。3 結(jié)論與討論EBP1 是擬南芥中和人類 ErbB-3 表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白 同源 的一個(gè)基因， 與核糖體的生物合成有關(guān)， 可以同時(shí)控制細(xì)胞 的分裂和延伸， 從細(xì)胞數(shù)量和體積 2 個(gè)方面同時(shí)調(diào)控植物器官大 小。 EBP1 基 因以劑量依賴型方式調(diào)節(jié)植物器官大小

13、，同時(shí)也以 生長(zhǎng)素依賴形式對(duì)細(xì) 胞周期調(diào)節(jié)因子進(jìn)行調(diào)控 12 ，該基因與蛋 白合成密切相關(guān)， 并參加 調(diào)控細(xì)胞周期， 在調(diào)節(jié)植物器官大小方 面具有重要意義。楊樹(shù)是重要的用材和綠化樹(shù)種，具有經(jīng)濟(jì)和生態(tài)雙重價(jià)值。 但和其 他絕大多數(shù)木本植物一樣， 楊樹(shù)生長(zhǎng)周期也較長(zhǎng)， 遺傳背 景復(fù)雜，很 難在短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出大量突變體。因此，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì) 楊樹(shù)等木本植物器 官形態(tài)建成及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制等基本問(wèn)題 的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于擬南芥等 草本植物。而 2006 年楊樹(shù)全基因組 測(cè)序的完成 21 及隨后不斷豐富完 善的楊樹(shù)及其近源種的 EST 數(shù)據(jù)信息， 為采用生物信息學(xué)手段結(jié)合反 向遺傳學(xué)策略探究楊樹(shù) 生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制等基本問(wèn)題提供了一條有效途徑。本研究通過(guò)克隆獲得的楊樹(shù) PtEBP1 基因應(yīng)屬于