紅曲代謝產(chǎn)物Monascin制備及其抗腫瘤作用研究

1、紅曲代謝產(chǎn)物Monascin制備及其抗腫瘤作用研究2課題背景及立論依據(jù)紅曲霉菌我省最具特色的微生物資源，經(jīng)固、液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅曲可用于釀酒、制醋，可作為食品染色劑和調(diào)味劑，含有多種活性代謝產(chǎn)物，作為中藥紅曲產(chǎn)品主要有發(fā)酵用紅曲、功能性紅曲和色素添加劑，其中色素紅曲、紅曲紅和紅曲黃色素等占紅曲產(chǎn)業(yè)鏈總產(chǎn)值的80%以上紅曲霉菌主要代謝產(chǎn)物紅曲色素、Monacolin 類化合物、-氨基丁酸、桔霉素等3課題背景及立論依據(jù) 紅曲色素紅曲霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物混合色素,醇溶性紅曲色素6種，水溶性4種醇溶性色素主要分為紅、橙、黃色素3類，每類色素各含兩種色素單體4課題背景及立論依據(jù)紅曲色素生理活性抗菌、降膽固醇、

2、抗阿爾茲海默癥、抗癌Ankaflavin（Y2）對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep G2具有細(xì)胞毒性，IC50值約為15 g/ml，而在同樣濃度下，對(duì)正常細(xì)胞系MRC-5和WI-38卻幾乎沒有細(xì)胞毒性。形態(tài)學(xué)變化研究和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期分布，發(fā)現(xiàn)有染色體皺縮及碎片，并有明顯的G1亞峰口服Monascin （Y1）可以抑制過氧化亞硝酸鹽或紫外線誘導(dǎo)的皮膚癌Rubropunctatin （O1）對(duì)人神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y、人胃癌細(xì)胞BGC-823、AGS和MNK45均具有顯著的增殖抑制作用，而對(duì)人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1則無(wú)細(xì)胞毒作用高純度紅曲色素具有成為新型抗癌藥物的潛力5課題背景及立論依據(jù)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞

3、分化細(xì)胞凋亡程序性細(xì)胞死亡，主要有線粒體路徑和死亡受體路徑誘導(dǎo)分化惡性腫瘤細(xì)胞在體外分化誘導(dǎo)劑的作用下，向正常細(xì)胞方向分化逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。 典型事例：全反式維甲酸（ATRA）治療急性早幼粒細(xì)胞白血病研究熱點(diǎn)從天然資源（包括動(dòng)植物、微生物等）中分離得到高純度的組分，并評(píng)價(jià)其抗癌活性和探索作用機(jī)理6實(shí)驗(yàn)路線高純度紅曲色素單體的制備紅、橙、黃3組紅曲色素抗腫瘤作用初篩(MTT實(shí)驗(yàn))紅曲色素單體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制探索對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS生長(zhǎng)抑制作用機(jī)理探索對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)理探索71 高純度紅曲色素提取分離乙醇萃取-高速逆流色譜法分離-結(jié)晶組合技術(shù)水提 30%醇提 70%醇提

4、70%醇提紅（Red-1和Red-2）、橙（Orange-1和Orange-2）、黃（Yellow-1和Yellow-2）色素為主要成分的提取液 提取圖1-1 HPLC-PAD檢測(cè)醇溶性紅曲色素組分81 高純度紅曲色素提取分離篩選出正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，制定了兩步分離策略，實(shí)現(xiàn)了6種組分的分離純化，純度高于90.0% 高速逆流色譜法n-hexaneethyl acetate methanolwater (10:0:7.5:2.5, v/v/v/v)n-hexaneethyl acetate methanolwater (2.5:7.5:5:5, v/v/v/v)圖1-2 高速逆流

5、萃取法分離醇溶性紅曲色素91 高純度紅曲色素提取分離采用熱飽和溶液法，獲得塊狀（紅）、針狀（橙）、片狀（黃）晶體，純度大于98.5% 結(jié)晶法圖1-3 6種紅曲色素樣品的檢測(cè)102 紅曲色素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響A375A431PC-3AGS2.1 MTT初篩（紅、橙、黃3組色素，24、48h）112 紅曲色素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響紅曲色素對(duì)4種細(xì)胞系的IC50（mol/L）groupsTime（h）Cell lines惡性黑色素瘤A375表皮鱗癌細(xì)胞A431前列腺癌細(xì)胞PC-3胃癌細(xì)胞AGS紅（R1+R2）24181.6251.5 147.3 121.3 48128.26 170.8 13

6、1.144.8橙（O1+O2）241051.5 806.9 985.4 723.3 482705.7 332.2 704.0 198.3 黃（Y1+Y2）24138.46146.6 108.9 27.3 4868.1 148.6 74.8 19.5 Taxol2417.115.6488.94.02.1 MTT初篩122 紅曲色素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)論：Monascin對(duì)正常組織細(xì)胞的抑制作用不及紫杉醇，其毒副作用較小，具有一定的安全性。圖2-1 Monascin和紫杉醇對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（24 h）2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒副作用133 Monascin對(duì)AGS

7、生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究control10mol/L80mol/L40mol/L 細(xì)胞核形態(tài)觀察均勻濃集皺縮碎裂圖2-2 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)（24 h）143 Monascin對(duì)AGS生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究劑量(mol/L)G0/G1SG2/MSub-G0/G1044.3534.5721.081.991041.0233.2825.701.622039.7530.2230.037.434043.7225.1431.1517.808043.6626.2830.0530.01處理時(shí)間G0/G1SG2/MSub-G0/G11252.2029.1318.674.892439.7530

8、.2230.037.433627.4144.8327.7626.274837.7646.9615.2937.003.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布153 Monascin對(duì)AGS生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究controlMonascin(20mol/L)Monascin(40mol/L)Monascin(10mol/L)Taxol(10mol/L)Taxol(20mol/L)3.3 Annexin V/PI 檢測(cè)細(xì)胞凋亡M1M2M3M4163 Monascin對(duì)AGS生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究1、control 2、20mol/L 3、40mol/L 4、80mol/LMonascin可能通過抑制Survi

9、vin表達(dá)，誘導(dǎo)AGS發(fā)生凋亡3.4 Survivin與Bcl-2含量檢測(cè)173 Monascin對(duì)AGS生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究隨著Monascin濃度的升高，Caspase-3酶活力顯著提高；50 mol/L作用24 h后，其酶活力是control組的倍。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力也顯著增長(zhǎng)。3.5 Caspase-3活性檢測(cè)184 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究 control 20mol/L 40mol/L60mol/L 80mol/L 100mol/L 細(xì)胞核形態(tài)觀察細(xì)胞核基本呈淡藍(lán)色均勻分布狀194 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究S期和G2/M期細(xì)胞的比例顯

10、著下降，G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高。48h后，90.4%的細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，而未見明顯的亞二倍體峰Control 6h 12h 18h 24h 48h53.9%90.4% 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布204 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究Monascin處理的A375細(xì)胞中黑色素含量顯著增大Groups（molL-1）melanin content（per 106cells）倍數(shù)control0.4730.006 1.00 200.3950.0020.84 400.6670.0081.41 601.1240.0142.38 801.5440.0223.26 A375細(xì)胞

11、黑色素含量變化214 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究Groups（molL-1）total activity of tyrosinas倍數(shù)control0.0280.0021.00 200.0300.007 1.07 400.0460.0061.64 600.0730.0102.61 800.1020.0133.64 Monascin處理的A375細(xì)胞中酪氨酸酶的總酶活力顯著增大 A375細(xì)胞酪氨酸酶活性的變化224 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究經(jīng)Monascin誘導(dǎo)后，出現(xiàn)細(xì)胞核縮小、胞漿比例增大、細(xì)胞器增多等典型的分化現(xiàn)象。 A：Control（12000

12、）；B：20mol/L（12000）；C：60mol/L（12000） 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)234 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究相對(duì)表達(dá)量 1 0.5 0.18 0 -actin(43kDa)P53(53kDa)A: control B: 20mol/L C: 40mol/L D: 80mol/LMonascin對(duì)A375細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，與細(xì)胞中p53基因調(diào)控有關(guān)4.6 P53蛋白含量檢測(cè)244 Monascin對(duì)A375生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究Monascin可抑制A375的體外運(yùn)動(dòng)能力。當(dāng)濃度為60 mol/L時(shí)，穿膜的細(xì)胞數(shù)僅為control組的40% 對(duì)A375細(xì)

13、胞遷移的影響25結(jié)論1. 紅曲霉菌Monascus sp. Strain FZK經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵、乙醇提取、高速逆流萃取技術(shù)和結(jié)晶方法，得到6種高純度色素組分。HPLC-MS及核磁共振鑒定，6種色素成分分別為紅曲素Monascin、紅曲黃素Ankaflavin、紅斑紅曲素Rubropunctatin、紅曲玉紅素Monascorubrin、紅曲玉紅胺Rubropunctatamine和紅斑紅曲胺Monascorubramine。2.通過MTT法檢測(cè)紅色素、橙色素和黃色素對(duì)AGS、PC-3、A375、A431四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，紅色素和黃色素對(duì)4株腫瘤細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用。黃色素對(duì)

14、AGS的增殖抑制作用最為顯著，其24、48、72 h的IC50分別為、 mol/L。黃色素對(duì)A375的增殖抑制作用居第二，其24、48、72 h的IC50分別為、70.7 mol/L。26結(jié)論3.Monascin對(duì)AGS增殖的抑制作用通過誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道Hoechst 33258染色細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮、碎裂和凋亡小體等典型凋亡特征細(xì)胞周期分布檢測(cè)，表明Monascin處理的AGS細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象，隨時(shí)間濃度升高，亞二倍體峰比例增大Annexin V/PI檢測(cè)結(jié)果表明，AGS細(xì)胞經(jīng)Monascin處理后凋亡細(xì)胞的比例遞增蛋白免疫印跡檢測(cè)Monascin作用后AGS細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)量顯著下降，而Bcl-2蛋白表達(dá)量未見明顯變化Caspase 3酶活力顯著升高提示Monascin通過下調(diào)AGS細(xì)胞中凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，激活細(xì)胞Caspase家族蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡27結(jié)論4.Monascin對(duì)A375增殖的抑制作用通過誘導(dǎo)分化實(shí)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道Hoechst 33258染色和細(xì)胞周期分布檢測(cè)結(jié)果表明Monascin處理的A375細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象，隨時(shí)間濃度升高，其比例增大，未見亞二倍體峰比例顯著升高檢測(cè)Monascin處理的A375細(xì)胞