生物化學(xué)教學(xué)課件：第14章 基因重組和基因工程

1、 基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第14章DNA克隆、測(cè)序與重組技術(shù)的歷史1973年，Stanley Cohen等人首次獲得體外重組DNA的分子克隆1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的化學(xué)裂解DNA測(cè)序問(wèn)世不久，Sanger 等的雙脫氧測(cè)序法20世紀(jì)90年代啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)重組DNA技術(shù)學(xué)(Recombinant DNA Technology)接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (t

2、ransduction)轉(zhuǎn) 座重組 (transposition)同源重組 (homologous recombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（general recombination）。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，

3、了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組E.Coli的同源重組機(jī)制RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性：核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、解螺旋酶Chi位點(diǎn)：序列為5GCTGGTGG3，是目前發(fā)現(xiàn)的主要重組熱點(diǎn)RecA酶：E.coli同源重組過(guò)程中最重要的酶，又稱為重組酶。可結(jié)合單鏈DNA，并將此DNA插入雙鏈DNA分子的同源區(qū)，完成DNA分子間單鏈交換的重組過(guò)程。Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟： 兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patch recombinant)拼接重組體(splice recombinant) 一或兩個(gè)DNA中的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成H

4、olliday中間體；通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為： 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353Holiday中間體535353535535533335555333355553335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體片段重組體Holliday模型異源重組體的修復(fù) 異源雙鏈重

5、組體內(nèi)不配對(duì)片段的DNA修復(fù)二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如 F 因子(F factor) 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基

6、因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。噬菌體的生活史溶源菌生長(zhǎng)途徑 (lysogenic pathway) “和平共處”溶菌生長(zhǎng)途徑 (lysis pathway) “殺死宿主”三、位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination)位點(diǎn)特異性重組發(fā)生在特殊序列對(duì)之間，這一重組型式最早在噬菌體的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)。噬菌體有兩種存在型式：裂解狀態(tài)和溶源狀態(tài)。兩種類型間的轉(zhuǎn)換通過(guò)位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)。溶源菌生長(zhǎng)途徑 溶菌生長(zhǎng)途徑 噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long t

7、erminal repeat, LTR)。 （一）噬菌體DNA的整合噬菌體DNA的整合與切除為了進(jìn)入溶源狀態(tài)，游離的 DNA必須整合（intergrate）到細(xì)菌DNA中去；而為了從溶源狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)化，原噬菌體DNA則必須從細(xì)菌染色體DNA上切除（excise）。整合和切除均通過(guò)細(xì)菌DNA 和DNA上特定位點(diǎn)附著點(diǎn)（attachment site，att）之間的重組而實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌染色體上的附著點(diǎn)（att）稱為attB ，含有B、O、和B三個(gè)序列（BOB），長(zhǎng)度約25bp。 attB突變后可以阻止DNA的整合。O 序列15bp噬菌體的附著位點(diǎn)稱attP，由P、O和P 三個(gè)序列組成，長(zhǎng)度約為24

8、0bp。其中O 序列是attB 和attP 所共有的，序列完全一致，長(zhǎng)度15bp, 稱核心序列（core sequence）。是位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方。O 序列Integration Host Factor2. -DNA從E.coli的切離：噬菌體的整合和切除1. -DNA對(duì)E.coli的整合：BOPPOB（原噬菌體）BOB（細(xì)菌）+POP （噬菌體）IntIHFBOPPOB（原噬菌體）BOB（細(xì)菌）+POP （噬菌體）Int，XisIHF整合過(guò)程 整合后的附著位點(diǎn)為 attL（BOP） attR（POB） 整合位點(diǎn)-attB、attP 切除位點(diǎn)-attL、attR 整合過(guò)程需要Int 和I

9、HF共同作用切除過(guò)程還需要Xis蛋白，Xis 通常抑制整合。 調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 LTR gag pol env src LTR 長(zhǎng)末端重復(fù)序列癌基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒表面糖蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶 產(chǎn)生病毒 垮膜蛋白反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生p60src蛋白質(zhì)，靶蛋白磷酸化（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。鼠傷寒沙門氏菌有兩相:相：由H1基因表達(dá)產(chǎn)生H1鞭毛蛋白相：由H2基因表達(dá)產(chǎn)生H2鞭毛蛋白兩相細(xì)菌在進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，以大約1/1000的頻率產(chǎn)生另一相的后代，此過(guò)程稱為相變（phase variation）。相變的實(shí)質(zhì)是Hl 或H2基因選擇性表達(dá)的結(jié)果 H2鞭毛素 阻遏

10、蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H抗原刺激機(jī)體后主要產(chǎn)生IgG，H抗原分析是沙門氏菌定型的依據(jù)。自然界中存在著數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的各種抗原物質(zhì)，若一種抗體分子特異性識(shí)別和結(jié)合一種抗原，體內(nèi)如何產(chǎn)生這么多種類的抗體分子呢？抗體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的重要分子機(jī)制就是免疫球蛋白（IG）的基因重排。 免疫球蛋白的基因重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L

11、V D J C 免疫球蛋白（Ig）的結(jié)構(gòu)Ig由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。人免疫球蛋白染色體定位編碼的肽鏈基因符號(hào)染色體定位基因片段及排列組合數(shù)H鏈IgH14q32.3V65-D30-J6-C96530611700鏈Ig 2p11-12V50-J5-C505250鏈Ig 22q11.2V50-100-(J-C)4504200重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)存在保守的重組信號(hào)序列(recombination signal

12、sequence, RSS)。CACAGTG(NNNNNNN)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位點(diǎn)重組酶識(shí)別位點(diǎn)此重排的重組酶共有兩個(gè)，分別由基因rag1、2 (recombination activating gene)編碼。RAG1：識(shí)別9bp信號(hào)序列。RAG2：結(jié)合于RAG1，并在7bp序列處切割。單鏈切開(kāi)RAG1RAG2免疫球蛋白基因重排過(guò)程V片段J片段RSS間插DNARSSOHOHV片段J片段分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)V片段J片段單鏈切開(kāi)、轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接V片段J片段CACAGTG(NNNNNNN)ACAAAAACCGTG

13、TCAC(NNNNNNN)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位點(diǎn)重組酶識(shí)別位點(diǎn)基因拼接過(guò)程中的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)7nt切割位點(diǎn)9nt重組酶識(shí)別位點(diǎn)H重鏈L1 V1 Ln Vn D1-12 J1-4 CCL1 V1 LnVn J1-4 C 輕鏈轉(zhuǎn)錄、加工AAA翻譯新生多肽鏈成熟多肽鏈L1V1 LnVn D2J1 C CL1V1 D2J1 C CL1V1 D2J1 CL1 V1J1 C AAAL1V1J1C 組合成Ig分子小鼠Ig胚系基因片段和重鏈、輕鏈配對(duì)的多樣性 基因片段數(shù) 可變區(qū)基因 經(jīng)重排和隨機(jī)配對(duì)后 多肽鏈 VJ 重組方式 推算的多樣性數(shù)目 重鏈 1000124 V-D-J 4.

14、8104 輕鏈 250 4 V-J 1.0103 概念：由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。指DNA從一個(gè)位置移動(dòng)到基因組上另一個(gè)位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括：（一）插入序列(insertion sequences, IS) （二）轉(zhuǎn)座子（ transposons ）四、轉(zhuǎn)座重組 插入序列(insertion sequences, IS)組成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因保守性轉(zhuǎn)座(conse

15、rvative transposition) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposase Gene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因Barbara McClintock (1902-1992), Biologist.Nobel Prize for discover

16、ing jumping genes in corn-then in bacteria and humans. Cold Spring Harbor Laboratory. 細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座相關(guān)概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體基本原理 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系主要內(nèi)容：第二節(jié) DNA重組技術(shù)DNA Recombination Technique一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆(clo

17、ne):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。（一） DNA克隆分子克?。杭?xì)胞克?。簞?dòng)物克隆：克隆的不同層面應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等 目的： 分離獲得某一感興趣的

18、基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶（1）定義：識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶存在于細(xì)菌體內(nèi)，與細(xì)菌的甲基化酶構(gòu)成限制修飾體系。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)分子手術(shù)刀（2）限制酶的

19、分類: 類、 類、類（3）限制酶的命名 EcoR E：代表細(xì)菌的屬名co：代表細(xì)菌的種名R：代表菌株 ：發(fā)現(xiàn)次序名稱屬名種名株名序號(hào)來(lái)源菌株EcoREcoREscherichia coli RY13Hind HIndHaemophilius influenzae RdHpa HpaHaemophilus parainfluenzae（4）限制酶的特點(diǎn)識(shí)別序列：回文結(jié)構(gòu) 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5不同堿基個(gè)數(shù)的識(shí)別序列在基因組中的出現(xiàn)頻率：四：256bp六：4kb八：65kbBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTG

20、GACCTG+平端切口粘端切口切割方式來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶名稱 識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生突出末端:BamH

21、5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后產(chǎn)生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶（三）目的基因研究某個(gè)基因，或者要克隆某個(gè)基因用于生產(chǎn)大量DNA和蛋白質(zhì)分子,首先都要把它從龐大的基因組中分

22、離出來(lái)。你所感興趣和想研究的基因，稱為目的基因。基因組DNA (genomic DNA)cDNA (complementary DNA)（四）基因載體 定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA分子運(yùn)輸車克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源D

23、NA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 大小適宜，拷貝數(shù)多。易于從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，即易轉(zhuǎn)化。有利于篩選。質(zhì)粒上常帶有一個(gè)或兩三個(gè)抗藥基因。有限制性內(nèi)切酶的切口。 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列3.粘性質(zhì)粒(cosmid) 酵母人工染色體 (yeast artifici

24、al chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他克隆容量：質(zhì)粒：10kb 噬菌體22kb M13噬菌體1kb 粘粒40-50kb YAC：0.5-2Mb二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取克隆載體的選擇和構(gòu)建外源基因與載體的連接重組DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 基因工程的基本過(guò)程（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 ?；蚪MDNA文庫(kù)(genomic DNA library)cD

25、NA文庫(kù)(cDNA library)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR co

26、s20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù) mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 從cDNA文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)獲 取目的基因（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方

27、法也不同。 Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：優(yōu)點(diǎn)：使用范圍廣缺點(diǎn)：連接效率較低 目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自

28、連在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭(linker)連接5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體5人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCT

29、TAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌宿主菌細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)?shù)睦砘幚?，處于最適于接受重組體的狀態(tài)，稱感受態(tài)細(xì)胞。比如大腸桿菌在低溫下處于CaCl2溶液中一段時(shí)間，其膜通透性增加處于感受態(tài)。E.Coli感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)

30、方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體 乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖 乳糖類似物異丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。 IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。 LacZ基因編碼的-半乳糖苷酶 X-gal 藍(lán)色吲哚產(chǎn)物 藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal 試驗(yàn)）誘導(dǎo)物 Z Y X PO Z Y X PO乳糖標(biāo)志補(bǔ)救（-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLac Z藍(lán)色化合物X-gal互

31、補(bǔ)（藍(lán)白篩選）（LacZ基因 N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因 C端序列LacZ酶 Southern印跡（3）分子雜交法 原位雜交 當(dāng)溶液中的DNA分子經(jīng)高溫或高pH處理后，DNA雙鏈分子變性產(chǎn)生兩條單鏈，如果將溫度逐漸下降或pH恢復(fù)到中性，單鏈會(huì)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，重新形成氫鍵恢復(fù)到原來(lái)的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來(lái)源不同，只要它們之間的堿基順序同源互補(bǔ)或者部分同源互補(bǔ)，在條件適宜時(shí)，就可以全部或部分復(fù)性分子雜交。99原位雜交技術(shù) 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測(cè)特異的DNA或RNA序列。 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNA-DNA RNA-DNA

32、 三類雜交 RNA-RNA 優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。以特異序列為探針鑒定rDNA在染色體上的分布 雞的肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法 重組DNA技術(shù)操作過(guò)程為： 小結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體 重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達(dá)體系的建立： 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

33、（六）克隆基因的表達(dá) 標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn) E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1. 原核表達(dá)體系 (E.coli表達(dá)體系最為常用)大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法 將真核基因克隆到1個(gè)強(qiáng)大的原核promotor和SD的下游，使真核基因處于原核啟動(dòng)子的控制之下，轉(zhuǎn)錄物由于原核SD能與核糖體rRNA結(jié)合，可在原核表達(dá).這是克服1、2困難的好辦法。真核分離出mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA有

34、完整的編碼順序，但無(wú)內(nèi)含子。采用偽裝辦法：將真核基因插到原核基因某密碼之后，其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽，這樣表達(dá)的融合蛋白，可躲避細(xì)菌蛋白酶降解作用。1.細(xì)菌RNApol不能識(shí)別真核的promotor，故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄.2.從真核轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列,不能結(jié)合到細(xì)菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白.3.真核基因有內(nèi)含子,而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNA不能形成,不能表達(dá)真核蛋白 ;4.表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解. 優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) 轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞）表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之,并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。 疾病基因發(fā)現(xiàn): 脆性X綜合征Kallmann綜合征第三節(jié)重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)