植物病原菌的分離和培養(yǎng)

1、實驗三植物病原菌的分離和培養(yǎng)一、實驗?zāi)康脑谘芯坎≡男螒B(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對寄主植物的致病 性等多種試驗中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下， 病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將 病原菌單獨分選出來，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實驗室最基本的 操作技術(shù)之一。通過本次實驗學習植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用 的方法。二內(nèi)容、材料和方法分離材料的選擇分離材料的選擇對分離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響，因為在感病 植物受害部位的內(nèi)外，要有多種腐生菌，為減少腐生菌的污染，分離 所用的病害材料應(yīng)盡可能新鮮，并且最好在病、健交接處選材取樣。 病、健交接處，除材料新鮮，污染

2、的可能性小外，病原菌的生活力強、 比較活躍，容易分離成功。（二）分離方法病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實驗室最常見的方法有 組織分離法和稀釋分離法兩種。1.組織分離法：這種方法適用于大部分病菌的分離，此法又分為 小塊組織分離和大塊組織分離兩種方法。分別以玉米大斑病、小麥根 腐病和梨褐腐病為試材進行。葉斑病類病原菌的分離（玉米大斑病病菌的分離）取玉米大斑病病葉，在病、健交界處剪取23毫米長的病組織。 用10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）3-5min， 時間長短依病組織不同而異，然后直接移至PSA平板培養(yǎng)基上（為防 止細菌污染，可在培養(yǎng)基中加入1000ppm鏈霉素10毫升

3、），倒置于 20251室溫下，待菌落長出后挑取前緣菌絲，回接于PSA斜面培 養(yǎng)基上，在251溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡 檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得 了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進行純化，直至獲得 純培養(yǎng)。（2）種子內(nèi)部病原菌的分離（小麥根腐病菌的分離）選擇典型的小麥黑胚粒34個，在70%的酒精中浸23秒鐘 后，以鑷子夾住投入0.1%升汞溶液中表面消毒23分鐘（處理時 間可自30秒至30分鐘不等），然后取出小麥粒，以滅菌水沖洗3 次，再移至已倒好的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，注意要以小麥的黑胚 部位著靠在培養(yǎng)基上，倒置在251溫箱中培

4、養(yǎng)，待菌落長出后，挑 取前緣菌絲于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后，無菌條件下 鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。病組織內(nèi)部病原菌的分離（梨褐腐病菌的分離）取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在 燈焰滅過菌的解剖刀在果面病、健交界處切開，挑取豆粒大小的病組 織放到馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿放34塊，倒置于251溫 箱中培養(yǎng)23天。菌絲長出后轉(zhuǎn)至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。2.稀釋分離法：稀釋分離法適用于細菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的 真菌等病原菌的分離，本次實驗以白菜軟腐病作為材料進行分類離。白菜軟腐病最易伴生腐生細菌，分離時需以病組織接種健康

5、菜幫 上，經(jīng)數(shù)次轉(zhuǎn)種予以純化，其純化方法是將菜幫經(jīng)多次換水沖洗后， 再用無菌水洗三次，切成適當大小，放在15厘米直徑的培養(yǎng)皿中， 菜幫下襯以吸水紙保溫。用無菌解剖刀挑取病組織少許抹在菜幫的人 為傷口上，培養(yǎng)在2025下，經(jīng)1天左右呈現(xiàn)腐爛，如此反復(fù)轉(zhuǎn) 種幾次，至病斑純凈為止。分離時，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成 菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿3付，標好次序，其內(nèi)各置無菌水1毫升， 用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第1皿水中混合均勻，從中挑取一環(huán) 稀釋液至第2皿，再以同法稀釋成第3皿，取熔化后冷至45左右 的（一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基，每皿倒約15毫升

6、，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于2628 的溫箱中培養(yǎng)，12日后可見白色，圓形或近圓形直徑為12毫 米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜 面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn)45管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐 生細菌。以上分離實驗也可以劃線法進行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿， 每皿倒入約15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻， 制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個培養(yǎng)皿 平面培養(yǎng)基的左方長方形區(qū)內(nèi)劃平行線57條，再以此移置環(huán)繼續(xù) 向右（和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度）劃57條平行線，依 此法劃兩皿，倒置于26281溫箱中培養(yǎng)，12日后挑單個典型 菌落移

7、到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。如果因季節(jié)關(guān)系難得白菜軟腐病試材，則可用黃瓜細菌性角斑 病、棉花角斑病、水稻白葉枯病病葉作試材進行分離培養(yǎng)實驗。方法 是取新鮮病葉，在病、健交接處取幾小塊病組織，以無菌水經(jīng)多次換 洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窩內(nèi)（凹窩要經(jīng)兩次酒精火 焰消毒），以吸管吸取無菌水滴入窩，并以滅菌的玻璃棒搗碎病組織， 靜置幾分鐘可得菌懸液，之后以上述劃線法進行分離，注意葡萄糖對 稻白葉枯病菌有抑制作用，故分離稻白葉枯病菌不能用葡萄糖配制牛 肉膏蛋白月東培養(yǎng)基。三、實驗準備（一）清潔環(huán)境：分離工作嚴格說應(yīng)在無菌條下進行，無菌室或無 菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。若限于條件實驗只能在普通房

8、間進行 時，必須對房間進行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水， 以消除室內(nèi)塵埃，分離開始前準備好一切用品，避免工作過程中頻繁 走動，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺上鋪好濕毛巾，點燃酒精燈。（二）實驗材料及用品準備本次實驗3-5人一組，請認真檢查好下試材和用品是否齊備。1病組織材料小麥根腐病黑胚粒5粒。玉米大斑病病葉1片。白菜軟腐病病幫3塊（相鄰兩組共用）；梨褐腐病病果1個（相鄰兩組共用）。2用品準備0.1%升汞溶液（廣口瓶盛裝）；95%酒精（廣口瓶盛裝）；1000ppm鏈霉素；瓶裝牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基；瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基；此外，還有以下備品，無菌水1瓶，滅菌培養(yǎng)皿6付，滅菌1 毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和鑷子各1把，移植環(huán)，移植鉤、 酒精燈、琺瑯盤和試管架各1個，毛巾1條，玻璃鉛筆1支及火柴作業(yè)：每人交分離到的純菌種一支。五、思考題1分離植物病原菌常用的方法有幾種？這些方法適用于分離哪類病原菌？怎樣分離？2分離植物病原物時，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣？沒有新鮮病材料怎么辦?3試分析分離工作成敗的原因。附：關(guān)于柯赫氏證病法則（Kochfs postulate）1882年，柯赫（Koch ）在研究了人和動物的病害之后，提出了確 定一種微生物致病性的三個必要條件：（一）這種微生物經(jīng)常與某種病 害有聯(lián)系，發(fā)生這種病害