核酸的生物有機(jī)化學(xué)課件

1、第 三 章核酸的生物有機(jī)化學(xué)（上）13.1 核酸和生命遺傳的化學(xué)本質(zhì) 在活細(xì)胞的各種組分中，核酸是非常重要的生物大分子之一。 在自然界中，生物能夠一代一代地遺傳下去，而且它們的各種生物特性得以繼續(xù)保留。 遺傳物質(zhì)是什么？ 遺傳信息是如何傳遞的？ 遺傳信息與蛋白質(zhì)的氨基酸順序有什么關(guān)系？在細(xì)胞中，遺傳物質(zhì)是一種特殊的生物大分子DNA（脫氧核糖核酸）。DNA兼具儲存和傳遞“遺傳信息”的雙重功能。2 DNA遺傳信息的傳遞，主要是由三個步驟組成。第一步，DNA的復(fù)制。實際上是將親代DNA進(jìn)行拷貝，得到子代DNA的過程。子代DNA保留了親代DNA全部遺傳信息。第二步，由DNA轉(zhuǎn)錄成RNA（核糖核酸）。在

2、這一步中，部分DNA的遺傳信息被轉(zhuǎn)錄到RNA上。第三步，RNA 所攜帶的遺傳信息翻譯和表達(dá)成具有一定的氨基酸順序的蛋白質(zhì)。33.2 核酸（DNA和RNA）的結(jié)構(gòu) 核酸（nucleic acids）包括DNA（deoxyri -bonucleic acid）和RNA（ribonucleic acid）兩大類。DNA是最基本的遺傳信息物質(zhì)。RNA則起著幫助傳遞和表達(dá)遺傳信息的作用。它們在結(jié)構(gòu)上很相似都是鏈狀聚合物。1. 構(gòu)成DNA和RNA的結(jié)構(gòu)單元分子 DNA和RNA都是由結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)單元分子連連接而成的多聚體。DNA和RNA的結(jié)構(gòu)單元分子分別由三種簡單分子所組成，即戊糖、含氮堿基和磷酸。4 戊

3、糖：組成DNA結(jié)構(gòu)單元分子的是脫氧核糖（2-deoxyribose），組成RNA結(jié)構(gòu)單元分子的是核糖（ribose）。D-核糖D-2-脫氧核糖5 含氮堿基和核苷：組成核酸結(jié)構(gòu)單元分子的含氮堿基有五種。其中兩個是嘌呤（purine）的衍生物： 腺嘌呤（Adenine, A）和鳥嘌呤（Guanine, G）；三個是嘧啶（pyrimidine）的衍生物：胞嘧啶 （Cytosine, C）、胸腺嘧啶（Thymine, T）和尿嘧啶（Uracil, U）。6DNA中存在四種堿基： 腺嘌呤(A)，鳥嘌呤 (G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)RNA中存在四種堿基： 腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)

4、和尿嘧啶(U)7 脫氧核糖(或核糖)中C1上的半縮醛羥基(-構(gòu)型)與嘌呤堿基的N9-H或嘧啶堿基的Nl-H脫水生成 C-N糖苷鍵，形成相應(yīng)的核苷(nucleoside)。核苷8 磷酸和核苷酸：核苷的核糖C5上的羥基與磷酸所形成的磷酸酯，稱為核苷酸(nucleotide)。核苷酸是構(gòu)成核酸(DNA和RNA)的結(jié)構(gòu)單元分子。核苷酸92. 多聚核苷酸 通過核苷酸的磷酸基與另一分子核苷酸的核糖 C3上的羥基形成磷酸二酯橋相連而成的長鏈結(jié)構(gòu)化合物多聚核苷酸，即DNA或RNA（見圖3-1）。 多聚核苷酸鏈具有如下特點(diǎn)： 多聚核苷酸是通過5-3磷酸二酯鍵連接而成。鏈的一端一般含有一個游離的5-磷酸基，另一端

5、則有一個游離的3-羥基。多聚核苷酸鏈具有方向性，必須注明(如53或35)。1011 多聚核苷酸是由含有不同堿基的核苷酸組成。因此具有一定的核苷酸順序，即核酸的堿基順序。核酸的堿基順序是核酸的一級結(jié)構(gòu)。核酸的堿基順序具有極其重要的生理意義。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息儲存的分子形式。 多聚核苷酸的結(jié)構(gòu)也可以簡化為：腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶12上述多聚核苷酸的核苷酸順序可表示為： 5PAPCPGPTPT3如果僅僅只關(guān)心其中的堿基順序，則可以寫成： 5ACGTT3注意：上式所表示的核苷酸順序是從左至右53。133. DNA 的結(jié)構(gòu) 1953年，Watson J和Crick F在前人的研

6、究工作基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA結(jié)晶的X衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋(DNA double helix)結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生理意義作了科學(xué)的解釋和預(yù)測。Watson和Crick的發(fā)現(xiàn)，是20世紀(jì)最偉大的科學(xué)成就之一。14 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)具有如下幾個特點(diǎn)。 DNA分子由兩條多聚核苷酸鏈組成。兩條鏈沿著一個共同的軸平行盤繞，形成(右手)雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條DNA鏈方向為53, 而另一條鏈方向為35。 嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90。15 螺旋的橫截面的直

7、徑約為20。每條鏈相鄰兩個堿基之間軸距為3.4。每10個核苷酸形成一個螺旋。螺旋的螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為34。 兩條多聚核苷酸鏈的盤繞力是鏈間的堿基對所形成的氫鍵，堿基對的形成有嚴(yán)格的配對規(guī)律：16 因此，在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。17 DNA的復(fù)制及其生理意義：Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)不久，就提出了著名的DNA復(fù)制(replication)機(jī)制假說，其要點(diǎn)是： DNA在復(fù)制過程中，組成雙螺旋的兩條DNA鏈先 拆分成兩條單鏈； 以DNA單鏈為模板，合成與模板完全互補(bǔ)的新鏈，并形成一個新的DNA雙螺旋分子。經(jīng)過一個復(fù)制周期后，子代 DNA分

8、子的兩條多聚核苷酸鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復(fù)制(semiconservative replication)。18 DNA復(fù)制理論是生物基因遺傳的最基本分子機(jī)制。1958年，科學(xué)家們用實驗精確地證明了DNA復(fù)制理論的正確性。 DNA的三螺旋結(jié)構(gòu)： 1957年，Rich A 等用兩條多聚尿嘧啶核苷酸鏈(poly U)和一條多聚腺嘌呤核苷酸鏈(poly A)合成出一種三鏈結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，并提出了DNA三螺旋結(jié)構(gòu)(triple helix)的概念。近年來，對于DNA三螺旋結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，認(rèn)為它在阻斷基因轉(zhuǎn)錄和對 DNA進(jìn)行“分子剪切”方面具有潛

9、在的應(yīng)用價值，因而引起了廣泛的關(guān)注。19 DNA的三螺旋與雙螺旋相似，都是通過DNA單鏈之間形成氫鍵實現(xiàn)的。DNA三螺旋結(jié)構(gòu)具有如下一些特點(diǎn)： 組成三螺旋的DNA單鏈，一般都是由單一的嘌呤堿基(A和G)或單一的嘧啶堿基(C和T)所組成。 DNA三螺旋的基本結(jié)構(gòu)有兩種。一種是由兩條多聚嘧啶堿基核苷酸鏈和一條多聚嘌呤堿基核苷酸鏈組成，簡單表示為：嘧啶-嘌呤-嘧啶。三條鏈中堿基形成氫鍵的情況是：T-A-T, C-G-C。20 第二種是由兩條多聚嘌呤堿基核苷酸鏈和一條多聚嘧啶堿基核苷酸鏈組成，簡單表示為：嘌呤-嘌呤-嘧啶。三條鏈中堿基形成氫鍵的情況是：A-A-T, G-G-C。上述兩種結(jié)構(gòu)中，中間的堿

10、基必須是嘌呤堿基。 每一條單鏈至少由8個核苷酸組成。 21 DNA三螺旋形成的條件是比較特殊的，因而在生物體內(nèi)存在的可能性較小，但在實驗室中則容易實現(xiàn)。目前，關(guān)于DNA三螺旋的生物學(xué)意義還只是一些預(yù)測，顯然，在這方面進(jìn)行深入的研究是很有意義的。224. RNA的結(jié)構(gòu)和分類 RNA與DNA在結(jié)構(gòu)上有明顯的差異。除了核苷酸的組成不同外，更重要的是表現(xiàn)在立體結(jié)構(gòu)上。 RNA是單鏈分子：RNA分子是單多聚核苷酸鏈。在RNA分子中，并不遵守堿基種類的比例關(guān)系，即RNA分子中嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基總數(shù)。在RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可形象地稱

11、為“發(fā)夾型”(hairpin loops)結(jié)構(gòu)，見圖3-6。 23 RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基配對情況并不如DNA中嚴(yán)格。G除了可以和C配對以外（主要配對方式），也可以和U配對。但是G-U配對形成氫鍵能力較弱。注意：24 RNA的分類：RNA的基本功能是負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的傳遞、翻譯和表達(dá)。根據(jù)RNA功能不同可以分為三類。 mRNA(messenger RNA, 信使RNA):mRNA約占細(xì)胞中RNA總量的5%。不同類型mRNA的鏈長差別很大。它的功能是將DNA遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)生物合成基地，并作為蛋白質(zhì)生物合成的模板。25 tRNA(transfer RNA, 轉(zhuǎn)移-RNA):tRNA約占R

12、NA總量的15%。它的特點(diǎn)是不同種類的tRNA雖然堿基順序不同，但其大小和形狀差別不大，鏈長平均約為75個核苷酸。tRNA的功能是將mRNA所攜帶的蛋白質(zhì)氨基酸順序信息翻譯成相應(yīng)的氨基酸，并將氨基酸以活化的形式運(yùn)送到核糖核蛋白體合成蛋白質(zhì)。因此，20種基本氨基酸，每一種最少有一個相應(yīng)的tRNA。26 rRNA(ribosomal RNA, 核糖體-RNA): 它約占 RNA的80%, 是組成蛋白質(zhì)合成基地核糖核蛋白體的主要成分。rRNA結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，它的詳細(xì)作用機(jī)制目前還不很清楚。273.3 核酸和生命遺傳的化學(xué)本質(zhì) 含氮堿基：嘌呤堿基和嘧啶堿基是核酸中最重要的組分。它們的性質(zhì)和反應(yīng)性能對于核

13、酸的性質(zhì)和生理功能具有重要影響作用。 嘌呤堿基和嘧啶堿基都是高熔點(diǎn)(300以上)的無色晶體物質(zhì)。在水中溶解度很小，當(dāng)它們轉(zhuǎn)變成核苷或核苷酸后，溶解度大大增加。它們都是弱堿性化合物。281. 堿基環(huán)的芳香性和互變異構(gòu) 嘌呤堿基和嘧啶堿基的雜環(huán)體系具有芳香性，并且存在互變異構(gòu)現(xiàn)象。2930 不同的異構(gòu)體形成氫鍵的能力和方向也有明顯差別（圖中用箭頭表示形成氫鍵的情況：表示氫給體，表示氫受體）。 堿基環(huán)互變異構(gòu)的方向，主要取決于介質(zhì)的條件，其中影響最大的是pH值和溫度。由于不同的互變異構(gòu)體形成氫鍵的能力和方向差異很大，因此對核酸的立體結(jié)構(gòu)有很大的影響。312. 堿基的堿性 嘌呤堿基和嘧啶堿基都具有弱堿

14、性。雜環(huán)上氨基的pKa值約為9.5。例如，尿嘧啶中N1或N3上質(zhì)子離解的pKa值為9.5；腺嘌呤N9上質(zhì)子離解的pKa值為9.8。32 堿基環(huán)上氨基的堿性可以從陰離子的共振穩(wěn)定性和環(huán)上氮原子的sp2雜化來解釋。環(huán)外的氨基（存在于A, G, C三種堿基中）的堿性很弱，在生理pH條件下不能質(zhì)子化，這種情況與苯氨的氨基相似。因此嘌呤和嘧啶堿基的堿性主要是環(huán)上氨基的貢獻(xiàn)。3. 嘌呤和嘧啶堿基的化學(xué)反應(yīng) 含氮堿基的化學(xué)性質(zhì)主要決定于氮原子的存在狀態(tài)。33 親電取代反應(yīng)：在嘧啶環(huán)上含有兩個氮原子，由于電子效應(yīng)的結(jié)果，使C5上的電子云密度比其他碳原子高一些，因此對親電取代反應(yīng)最敏感。與此相似，嘌呤環(huán)中，C8

15、的電子云密度比C2和C6高 ，因此C8對親電取代反應(yīng)也最敏感。34嘌呤和嘧啶堿基可以發(fā)生多種親電取代反應(yīng)。主要的反應(yīng)有： 尿嘧啶核苷的氯代：35 腺嘌呤核苷的溴代 生成的8-溴腺嘌呤核苷可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成多種腺苷衍生物：36 尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶核苷： 5-甲基胞嘧啶的生物合成：RNA或DNA中的胞嘧啶，在甲基化酶(methylase)的作用下，能與SAM作用，轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶。37 親核-加成消除反應(yīng)：堿基的含氮雜環(huán)中各個原子上的電子云密度分布是不均勻的，在一定條件下也可以發(fā)生親核加成反應(yīng)。 水解反應(yīng)：含有羰基的堿基(G,C,T,U), 從結(jié)構(gòu)上看具有酰胺鍵特點(diǎn)。因此在堿性條下，能發(fā)生

16、水解開環(huán)反應(yīng)：S-腺苷甲硫氨酸38腺嘌呤堿基不含羰基，因此對堿比較穩(wěn)定。 與肼的反應(yīng)：嘧啶堿基能與肼作用，得到兩種不同的產(chǎn)物： 39此反應(yīng)只發(fā)生在嘧啶堿基，而嘌呤堿基不能發(fā)生這類反應(yīng)，因此在核酸分析中有重要的應(yīng)用價值。與羥胺的反應(yīng)：嘧啶堿基能與羥胺反應(yīng)，環(huán)外的 氨基也會受到影響。40尿嘧啶核苷與羥胺在pH=910條件下反應(yīng)時，將發(fā)生堿基開環(huán)分解反應(yīng)： 41 氨基的烷基化反應(yīng)：在一般烷基化反應(yīng)條件下，含氮堿基的烷基化反應(yīng)主要發(fā)生在雜環(huán)的氮原子上，不同的烷基化劑，烷基化產(chǎn)物也有所不同。以上烷基化反應(yīng)活性順序是 G A C。在此條件下，U和T基本上不起反應(yīng)。典型的烷基化產(chǎn)物如下:42 在溫和的堿性條

17、件下，1-甲基腺嘌呤核苷可以發(fā)生Fischer-Dimoth重排，得到環(huán)外氨基的甲基化產(chǎn)物：43 用CH2N2做烷基化劑，則所有含氮堿基都能發(fā)生烷基化反應(yīng)，反應(yīng)活性順序是：UT G C A。 環(huán)外氨基的反應(yīng)：環(huán)外的氨基雖然不活潑，但在適當(dāng)條件下，也可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉(zhuǎn)變成尿嘧啶核苷。因此生物體內(nèi)亞硝酸的存在有可能改變DNA的堿基組成。44 腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應(yīng)，分別生成次黃嘌呤核苷（inosine）和黃嘌呤核苷 （xanthosine）。這種堿基的變化，將影響或改變形成氫鍵的能力和方向，導(dǎo)致DNA復(fù)制錯誤，是引起基因突變的重要原因

18、之一。45 光聚合反應(yīng)：胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以 發(fā)生二聚加成反應(yīng)： 在DNA分子中，如果兩個胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外光照射下，即可能發(fā)生上述聚合反應(yīng)，其結(jié)果是破壞了DNA分子復(fù)制功能。46 環(huán)外氧原子的烷基化反應(yīng)：鳥嘌呤6位上的羰基可以異構(gòu)化成烯醇式異構(gòu)體。因此在一定的條件下可以發(fā)生烷基化反應(yīng)。DNA用甲基化劑處理，可以得到6-甲氧基鳥嘌呤。甲基化的鳥嘌呤不再與胞嘧啶配對，而與胸腺嘧啶配對。正常情況與胞嘧啶配對烷基化后與胸腺嘧啶配對47常用的烷基化劑主要有： 含氮堿基的紫外吸收光譜：嘌呤堿基和嘧啶堿基中都存在有-電子共軛的雜環(huán)體系。因此在紫外區(qū)都有特征吸收峰。核酸的UV最大吸收約為2

19、60nm，利用這一性質(zhì)可以和蛋白質(zhì)區(qū)別開來（蛋白質(zhì)的UV最大吸收峰為280nm左右）。483.4 核酸的性質(zhì)1. 核酸的離解性質(zhì) 多聚核苷酸鏈中含有兩類可離解的基團(tuán)。 多聚核苷酸鏈的離解性質(zhì)與多肽鏈情況相似，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。由于磷酸是一個中等強(qiáng)度的酸，而含氮堿基堿性很弱，因此核酸的等電點(diǎn)都在低pH值范圍內(nèi)。DNA的等電點(diǎn)為44.5，RNA的等電點(diǎn)為22.5。DNA和RNA等電點(diǎn)相差較大這一特點(diǎn) ，在DNA和RNA分離中具有重要意義。49 DNA和RNA等電點(diǎn)相差較大的原因，很容易從它 們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來理解。RNA鏈中，核糖2 -OH的氫原子能與磷酸酯中的羥基氧原子形成氫鍵，促進(jìn)了磷

20、酸酯羥基中氫原子的離解。2. 核酸的水解 酸或堿水解：多聚核苷酸鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下能被酸或堿水解成核苷酸。但是DNA和RNA對酸或堿的穩(wěn)定性有很大的差別。例如，在室溫條件下，用 0.1 mol/L NaOH溶液即可將RNA完全水解，得到2-或 3-磷酸核苷的混合物。 50 在相同條件下，DNA則不受影響，說明DNA比 RNA要穩(wěn)定得多。這是因為，RNA分子中核糖2-OH的存在促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解過程。DNA和RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。51 DNA作為遺傳信息的攜帶者，要求具有一定的穩(wěn)定性，而RNA 在大多數(shù)情況下是作為DNA的信使，完成任務(wù)后即分解掉，所以要求RNA具有易被

21、水解的特性。 酶水解：在生物體內(nèi)存在著多種核酸水解酶 (nuclease)。這些酶可以水解多聚核苷酸中的磷酸二酯鍵。核酸水解酶一般可分為RNA水解酶(RNases)和DNA水解酶(DNases)。核酸水解酶還可以根據(jù)其水解核酸方式分為兩類： 核酸外切酶 (exonucleases): 能夠從多聚核苷酸鏈的一端(3-端或5 -端 ) 開始，逐步將核苷酸水解下來。52 核苷酸內(nèi)切酶(endonucleases):能夠水解多聚核苷酸鏈中某種核苷酸形成的磷酸酯鍵。不同的核酸水解酶的水解產(chǎn)物核苷酸也不同，可以是5-單磷酸核苷或 3-單磷酸核苷。 最有意義的核酸水解酶是限制性核酸內(nèi)切酶 (res- tri

22、ction endonucleases)。它可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。因此在核酸分子結(jié)構(gòu)研究、基因重組技術(shù)等方面具有重要價值。下面是幾種DNA 限制性內(nèi)切酶水解DNA的例子。這些內(nèi)切酶能夠識別并水解某些具有對稱因素的堿基順序的部位。5354 核酸水解酶催化水解的機(jī)制比較復(fù)雜。目前研究得比較清楚的是牛胰腺核糖核酸酶A(bovine pancreatic ribonuclease A, 簡稱RNase A)。它能水解RNA鏈中含嘧啶堿基的核苷酸與含嘌呤堿基核苷酸之間形成的磷酸酯鍵，得到3-單磷酸核苷。水解反應(yīng)機(jī)制見圖4-7。553.5 核酸堿基順序分析中的化學(xué)反應(yīng) 1. Maxa

23、m-Gilbert堿基順序分析法 核酸的堿基順序分析是核酸化學(xué)和分子生物學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。1975年，Maxam A和Gilbert W發(fā)展了一種核酸堿基順序快速分析方法。這種方法的基本原理是應(yīng)用有機(jī)化學(xué)方法，選擇性地切斷某種特定核苷酸(A, G, C, T)所形成的磷酸酯鍵。所以此法又稱為化學(xué)降解法(chemical cleavage method)。56 嘌呤堿殘基的選擇性水解：核酸中的嘌呤堿基和嘧啶堿基可以與硫酸二甲酯作用，但反應(yīng)條件及甲基化產(chǎn)物的性質(zhì)不同。在溫和的條件下，用硫酸二甲酯處理DNA, 分別得到兩種嘌呤堿基的甲基化產(chǎn)物：N3-甲基腺嘌呤核苷(N3-methyladenine)

24、和N7-甲基鳥嘌呤核苷(N7-methy1guanine)。57 不同堿基的甲基化產(chǎn)物對于水解去嘌呤堿基反應(yīng)敏感程度有明顯差別。N7-甲基鳥嘌呤核苷在中性條件下即能發(fā)生脫嘌呤堿基反應(yīng)，而N3-甲基腺嘌呤核苷則應(yīng)在酸性條件下才能發(fā)生脫嘌呤堿基反應(yīng)。脫去了嘌呤堿基的核糖磷酸酯鍵，在0.1mol/L NaOH堿性條件下可以被水解切斷。在此條件下，其余的磷酸酯鍵不受影響。5859 嘧啶堿殘基的選擇性水解：DNA鏈用肼處理，其中的嘧啶堿殘基被脫去，生成核糖腙衍生物，再在哌啶(piperidine)存在下水解，核糖腙3-位的磷酸酯鍵則被水解斷裂。6061 根據(jù)上面反應(yīng)原理，可以在不同反應(yīng)條件下，選擇性地切

25、斷分別由四種不同的核苷酸形成的磷酸酯鍵。注意：不論嘌呤堿基或嘧啶堿基，在選擇性水解后，在水解位點(diǎn)上的含氮堿基都消失了。 例如一個多聚核苷酸鏈5-ATTGACTTAGCC-3, 在一定條件下，在G處切斷（伴隨鳥嘌呤堿基脫去 ），則有以下幾種情況可能發(fā)生：62由此可見，一共可以得到6種不同的多聚核苷酸片斷（包括一條原來的DNA鏈）。它們可以用凝膠電泳(electroph -oresis)方法分離圖3-11(a)。63 但是在實際上，這種電泳圖譜還是很難解析。為了解決這個問題，Maxam和Gilbert找到了一個很好的解決辦法。在多聚核苷酸激酶作用下，將放射性同位素32p標(biāo)記到多聚核苷酸鏈的5-端上

26、：32P-ATTGACTTAGCC。這樣，用上述方法在 G 處切斷后得到的 6 個片斷中，有三個含有32p的標(biāo)記物，即32P-ATT, 32P-ATTGACTTA和32P-ATTGACTTAGCC。用放射顯影方法很容易識別圖3-11(b)。多聚核苷酸片斷的長度與它在凝膠電泳中移動的速率成反比。64 因此，根據(jù)圖3-11(b) ，很容易得出 G在多聚核苷酸鏈中所處的位置為第4和第10。再分別在A, C和T處切斷，即可將A, G, C, T在多聚核苷酸鏈中位置全部確定。Maxam-Gilbert堿基順序分析法主要過程如圖3-12所示。6566672. Sanger堿基順序分析法 1976年，Sanger F發(fā)展了一種新的核酸堿基順序分析法