紅細(xì)胞滲透脆性與白細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)總結(jié)課件

1、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn) 與羊血白細(xì)胞染色藥學(xué)2班 陳旭宇 李佳朋講解內(nèi)容實(shí)驗(yàn)概述預(yù)實(shí)驗(yàn)情況正式實(shí)驗(yàn)情況創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)概述 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察不同濃度的低滲鹽溶液對(duì)紅細(xì)胞的影響，加深理解細(xì)胞外液晶體滲透壓相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要意義。2、掌握白細(xì)胞染色的方法，理解瑞氏染液的作用。二、實(shí)驗(yàn)原理紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的低滲鹽溶液濃度為該血液紅細(xì)胞的最小抵抗力開始出現(xiàn)完全溶血時(shí)的低滲鹽溶液的濃度則為該紅細(xì)胞的最大抵抗力實(shí)驗(yàn)器材及藥品器材及藥品： 小試管、試管架、微量移液管 （1000uL與200uL兩種規(guī)格）顯微鏡、 載物玻璃片、170mmol/L NaCl溶液實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 抗凝羊

2、血 （抗凝血?jiǎng)闄幟仕徕c）預(yù)實(shí)驗(yàn)情況預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、觀察不同濃度的低滲鹽溶液對(duì)紅細(xì)胞的影響，加深理解細(xì)胞外 液晶體滲透壓相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要意義2、熟練白細(xì)胞染色的操作，理解瑞氏染液、吉姆薩染色的作用3、查閱相關(guān)文獻(xiàn)，加深對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解，掌握更全面信息4、總結(jié)實(shí)驗(yàn)的一些注意事項(xiàng)和操作技巧，預(yù)知實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問題，做好應(yīng)對(duì)措施5、清楚實(shí)驗(yàn)的大致結(jié)果，給同學(xué)們作為參考染色原理：血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白、淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞胞質(zhì)為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色或藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；預(yù)習(xí)探究一：由于開始的兩

3、次實(shí)驗(yàn)，我們都習(xí)慣先將羊血存于冰箱中保存，然后取出再在室溫下實(shí)驗(yàn)?？紤]到正式實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，我們會(huì)使用剛?cè)』氐难蜓ㄎ唇?jīng)冰箱冷卻實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行試驗(yàn)?？紤]到這些溫度和時(shí)間上的差異，我們有必要進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，來探究正式實(shí)驗(yàn)環(huán)境下的合理范圍。試管號(hào)試液12345678910170mmol/LNaCl（ml）1.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5蒸餾水（ml）0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5NaCl濃度（mmol/L）12011210495867869605243表1：各種低滲鹽溶液的制備實(shí)驗(yàn)溫度/離體時(shí)間/h最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/l）最小抵抗力

4、組別最小抵抗力濃度（mmol/l）181769586193769495225678310420858631041912495310417243104表2：第一次取血紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表3：第二次取血紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)溫度/離體時(shí)間/h最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/l）最小抵抗力組別最小抵抗力濃度（mmol/l）171769586203678495225678310421858631041712495310415243104 表4：第三次取血紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)溫度/離體時(shí)間/h最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/l）最小抵抗力組別最小抵抗力濃度（mmol/

5、l）19178658621367849525567849523858631042112586310420243104結(jié)論：1、血紅細(xì)胞離體時(shí)間越長滲透脆脆性越大；2、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)同一天內(nèi)的溫度變化在 1528范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影 響不明顯。3、羊血不經(jīng)冰箱儲(chǔ)存冷卻，在實(shí)驗(yàn)室溫度環(huán)境下，離體35h,預(yù)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：最小抵抗力濃度：95104mmol/L最大抵抗力濃度：6978mmol/L實(shí)驗(yàn)操作總結(jié)：（供以后實(shí)驗(yàn)同學(xué)們參考）a.溶液用前應(yīng)現(xiàn)配，以免水分蒸發(fā)，改變離子濃度。b.溶血的結(jié)果判斷，應(yīng)首先在室溫下靜置一個(gè)小時(shí)湖再觀察結(jié)果，先從高濃度觀察，上層初現(xiàn)透明紅色為開始溶血管，溶液透明深紅色、管底紅細(xì)

6、胞完全消失者為完全溶血。如不易判斷可低速離心1分鐘后觀察。c.器材必須清潔干燥，避免引起其他異物影響所致溶血。d. 紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)中，可以先向每個(gè)試管中加氯化鈉然后再加蒸餾水，加的時(shí)候還有個(gè)小技巧，以氯化鈉為例，先將幾個(gè)大于1000uL的試管中都加上1000uL的氯化鈉，然后再按900,800到100uL遞減的順序依次加這樣可以節(jié)省時(shí)間e.血必須直接注入試劑中，不可沿著管壁。試驗(yàn)中我們直接用的滴管取血，可能試管中的血量有差距，建議后面用微量移液器定量取血排除觀察溶血狀況時(shí)，血量不同帶來的影響f.血液和鹽溶液時(shí)不要用力震蕩，靜置及觀察時(shí)不要移動(dòng)試管。g.染色必須得等到血片干燥后進(jìn)行，否則染不上色

7、h.血膜的沖洗時(shí)水流不能太急，防止將血膜沖掉，應(yīng)用蒸餾水沖血片的上方，然后滑落下的水流沖洗血膜實(shí)驗(yàn)2：細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)藥品準(zhǔn)備：緩沖液配制：1%KH2PO4+1%NaHPO4(20ml),加水至1000ml，置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染。姆薩染液配制：藥品：吉姆薩染料（粉末）0.5g、甲醇 （AR）33ml、甘油（AR）33ml方法：先將吉姆薩染料放入研缽中，逐漸到甘油研磨溶于甘油中，置于58水溫箱內(nèi)90-120min，然后加入甲醇，搖勻后放置數(shù)天，過濾后或不過濾即可使用。 （此染液放置室溫陰暗處，時(shí)間越長越好）(2）實(shí)驗(yàn)過程開始時(shí)，一切從零開始，我們的血片制備很不合格，要么過厚，要么不均

8、勻。在耿姝學(xué)姐手把手講解之后，我們不耐其煩，連續(xù)聯(lián)系制作了近30個(gè)血片，終于能夠制作出厚度適宜，效果成功的血涂片，并掌握了制片的技巧。聯(lián)系生物實(shí)驗(yàn)一中白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)用白細(xì)胞液破壞紅細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，我們在染色之前對(duì)血液使用白細(xì)胞稀釋液排除干擾，但是染色結(jié)果與不加白細(xì)胞染色液相比反而較差，影響染色效果。分析原因有可能是白細(xì)胞染色液引起了PH的改變，或產(chǎn)生液膜稀釋了染液，最后否定了加白細(xì)胞稀釋液進(jìn)行染色的方案。經(jīng)驗(yàn)總結(jié)推片經(jīng)驗(yàn)： 用移液槍頭沾取羊血點(diǎn)置于載玻片上，呈米粒大小，將推玻片保持與載玻片約30度角，置于血滴正前方，稍往后移與血滴接觸，即可見血液沿推片下緣散開，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向后滑動(dòng)，至血

9、膜鋪勻。圖1 瑞氏染色法 圖2 吉姆薩氏染色法 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的各染色法染色效果：瑞氏染色法：白細(xì)胞核、細(xì)胞漿層次分明，嗜中性白細(xì)胞漿中可見淡紅色染色顆粒。吉姆薩氏染色法：白細(xì)胞核呈藍(lán)色，層次清楚。瑞吉復(fù)合染色法：白細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞漿中染色顆?？梢姟Ｕ綄?shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：我們在周三下午將PPT交與李老師征求修改意見，并在當(dāng)天晚上修改完畢。于周四晚上，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需各項(xiàng)儀器與藥品，并寫好板書。周五早上上課前取回羊血。實(shí)驗(yàn)過程：實(shí)驗(yàn)過程無遲到、曠課、早退現(xiàn)象，同學(xué)們熱情度很高，認(rèn)真實(shí)驗(yàn)。對(duì)同學(xué)的操作過程進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)，使絕大多數(shù)同學(xué)的實(shí)驗(yàn)取得了預(yù)期的結(jié)果，其中章夢甜、陶倩組白細(xì)胞染色觀察效果非常好，

10、能觀察到多個(gè)白細(xì)胞清晰鏡像。白細(xì)胞染色出現(xiàn)問題主要為以下幾點(diǎn)： 1、血膜涂得過厚，造成觀察困難； 2、對(duì)染液進(jìn)行沖洗時(shí)不徹底，造成著色過深，出現(xiàn)一大片藍(lán)的現(xiàn)象； 3、沖洗過猛，觀察不到白細(xì)胞。在老師和我們的幫助下，同學(xué)們很好解決了這些問題。掌握好染色時(shí)間、染液量和染液沖洗是關(guān)鍵不好，上圖為典型的染液沖洗不好的結(jié)果實(shí)驗(yàn)報(bào)告批改情況存在的問題與不足：漏寫：有些同學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器及藥品未寫全;或廠家未標(biāo)注;實(shí)驗(yàn)室溫度濕度等環(huán)境記錄;實(shí)驗(yàn)原理未寫或?qū)懙牟蝗?。討論：?shí)驗(yàn)結(jié)果分析不到位；實(shí)驗(yàn)操作中的討論過于寬泛；文獻(xiàn)內(nèi)容過多引用，缺乏自己的語言；一些討論不夠嚴(yán)謹(jǐn)，理論支持太少。創(chuàng)新：創(chuàng)新方面未結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情

11、況，有些不實(shí)用。有不少同學(xué)在報(bào)告中反映瑞士染色效果好于吉姆薩染色，這可能是由于正式實(shí)驗(yàn)中所使用吉姆薩染液比較新的原因。在吉姆薩染液放置一個(gè)月后，染色效果有很大提高，在我組后期染色操作中發(fā)現(xiàn)，吉姆薩染色效果要優(yōu)于瑞氏染液，因此總結(jié)到經(jīng)驗(yàn)：吉姆薩染液最好提前一個(gè)月配置，暗處放置。創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)1、進(jìn)一步探究溫度、離體時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)及滲透脆性 的影響；2、利用紫外分光光度計(jì)測不同地深鹽溶液中的溶血度；3、探究白細(xì)胞染色片中的藍(lán)紫色小顆粒聚集物來源4、改良白細(xì)胞染色方法一、探討離體時(shí)間、溫度對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)及滲透脆性的影響紅細(xì)胞滲透脆性受細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜流動(dòng)性、以及紅細(xì)胞幾何特性及紅細(xì)胞膜抗張強(qiáng)度等多個(gè)因素

12、的影響，其中與紅細(xì)胞表面面積和體積的比值有很大關(guān)系。通過批閱報(bào)告，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)同學(xué)沒有對(duì)不同濃度低滲鹽溶液中的血紅細(xì)胞進(jìn)行鏡檢,而且往屆助教也沒有進(jìn)行形態(tài)變化的觀察。1.2 方法:對(duì)三次取的羊血材料分別進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)操作。取適量新鮮羊血（A液）分別置于4個(gè)潔凈燒杯，標(biāo)號(hào)A1.A2.A3.A4 。實(shí)驗(yàn)過程中，各組羊血、低滲鹽溶液、A滴入B、均勻、靜置、觀察各步驟均在各自的恒溫環(huán)境中進(jìn)行。 表6 各種低滲鹽溶液(B液）的制備試管號(hào)試液12345678910170mmol/LNaCl（mL）1.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5蒸餾水（mL）0.60.70.80.91.01

13、.11.21.31.41.5NaCl濃度 （mmol/L）120112104958678696052431下羊血紅細(xì)胞均出現(xiàn)表面凹凸不平，呈不規(guī)則球形。有萎縮趨勢。紅細(xì)胞變化明顯，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變形嚴(yán)重，易發(fā)生溶血。聯(lián)系生物化學(xué)知識(shí)，降低溫度會(huì)抑制細(xì)胞各類酶的活性，如呼吸酶、轉(zhuǎn)氨酶等。導(dǎo)致細(xì)胞生物活性降低。細(xì)胞膜通透性能改變，紅細(xì)胞脆性增大。室溫下羊血紅細(xì)胞的變化比較明顯，部分細(xì)胞形狀變化嚴(yán)重，大多變癟，甚至有鐮刀狀紅細(xì)胞出現(xiàn)?？梢酝茢嘣谡星闆r下檢測出的紅細(xì)胞脆性肯定與在體的規(guī)則球形紅細(xì)胞的滲透脆性不同。38下保存的羊血紅細(xì)胞變化情況不如25的明顯，但是依然可以看出紅細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生變形，表面凹凸不

14、平，呈現(xiàn)不規(guī)則塊狀、橢圓狀、三角狀。51下保存的羊血紅細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的變形。大多數(shù)紅細(xì)胞變癟，呈鐮刀狀或飛碟狀。我們推測高溫使血液蒸發(fā)失水，血液中離子等溶質(zhì)濃度升高，滲透壓增大，導(dǎo)致紅細(xì)胞失水變癟。在加入少量 51蒸餾水稀釋后，部分細(xì)胞干癟情況減輕，形狀又恢復(fù)，但仍有許多飛碟狀、鐮刀狀細(xì)胞?？梢娺@種變化是多方面的，高溫對(duì)紅細(xì)胞的活性產(chǎn)生了不可逆的影響。 表7. 離體3h不同溫度下的羊血紅細(xì)胞脆性標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)溫度/最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/L）最小抵抗力組別最小抵抗力濃度（mmol/L）A11678586A225678495A338678586A451678586 表8. 離體5h不同溫

15、度下的羊血紅細(xì)胞脆性標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)溫度/最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/L）最小抵抗力組別最小抵抗力濃度（mmol/L）A11678495A225678495A338678586A451678586 表9. 離體12h不同溫度下的羊血紅細(xì)胞脆性標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)溫度/最大抵抗力組別最大抵抗力濃度（mmol/L）最小抵抗力組別最小抵抗力濃度（mmol/L）A11678495A225678495A338678586A451678586 表10. 25 下探究更準(zhǔn)確的最大最小抵抗力試管號(hào)試液123 45678170mmol/LNaCl（ml）1.281.261.241.221.081.061.041.02蒸

16、餾水（ml）0.720.740.760.780.920.940.960.98NaCl濃度（mmol/L）10910710510492908887實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、2、3、4、5、6管皆為上層透明紅色，下層渾濁紅7、8管為透明紅色1.4得出結(jié)論：溫度對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)有影響，其中高溫（51）對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)影響最大；相同溫度下，紅細(xì)胞的脆性隨時(shí)間的增長而變大；相同時(shí)間下，1和51下紅細(xì)胞脆性變大速度較室溫和體溫快，溫度偏離體溫程度越大，越容易使紅細(xì)胞脆性增大；保存環(huán)境的溫度對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)有很大影響。實(shí)驗(yàn)2、紅細(xì)胞在不同濃度低滲氯化鈉溶液中溶血率的測定2.1概述：傳統(tǒng)的測定方法采用目測觀察其溶血情況,需要靜置

17、一小時(shí)后觀察, 觀察過程中不能晃動(dòng)。此法僅能觀察到溶血的大致情況, 不能量化紅細(xì)胞破裂的程度。本試驗(yàn)采用分光光度法精確測定紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中的溶血情況。進(jìn)一步了解血紅蛋白的脆性。2.3實(shí)驗(yàn)步驟2.3.1配制不同濃度低滲氯化鈉溶液取口徑相同、清潔干凈的小試管做好編號(hào), 制成不同濃度的低滲鹽溶液, 每管總量為3.0mL，第11管為蒸餾水,具體配制情況見如下表所示：試管號(hào)試液123456789101112170mmol/LNaCl（ml）2.11.951.81.651.51.351.21.050.90.752.70蒸餾水（ml）0.91.051.21.351.51.651.81.952.12.

18、270.33.0NaCl濃度（mmol/L）1201121049586786960524319402.3.2 最大吸收波長測定取12管加入0. 1 mL血液, 輕輕顛倒混勻5 min,3 000 r/min離心10 min, 取上清液至比色皿中, 以11管(生理鹽水）為空白對(duì)照,754N紫外可見分光光度計(jì)上掃描,測得其最大吸收波長為590nm.2.3.3 紅細(xì)胞在不同濃度低滲氯化鈉溶液中溶血率的測定依次向12支試管內(nèi)各加0.1ml血液,輕輕顛倒混勻5min置入干燥離心管中以3000r/min 離心10min,取上清在分光光度計(jì)590nm波長處檢測。用11管生理鹽水的上清調(diào)零,測其他每管吸光度。

19、以12管測出的吸光度作最大溶血的吸光度,分別計(jì)算出1- 10支管的溶血率。溶血率 = （樣品吸光度/最大溶血吸光度）100% 。 表12 不同濃度低滲氯化鈉溶液對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 試管標(biāo)號(hào)NaCl溶液濃度（mmol/L）OD值溶血率（%）目測法11200.0799.5-21120.0829.8-31040.20724.8-4950.31237.3+5860.62474.6+6780.6678.9+7690.73888.3+8600.75490.2+9520.76791.7+10430.79595.1+11194001200.836100+ (注：-表示不溶血, +表示部分溶血, +表示完全

20、溶血)探究究竟對(duì)人體血液的影響，不應(yīng)該想當(dāng)然的在血液中直接加入酒精，而應(yīng)該分析究竟在人體的代謝產(chǎn)物，進(jìn)入血液的代謝產(chǎn)物是什么。酒精進(jìn)入體內(nèi)后在乙醇脫氫酶(ADH) 和乙醛脫氫酶(ALDH) 的作用下逐步氧化成乙酸,其中間代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)機(jī)體的毒性作用最大。2.4.2酒精、葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 酒精代謝過程：乙醇乙醛乙酸 乙醇乙醛 2CH3CH2OH + O2 2 CH3CHO + 2H2O 乙醛乙酸 2CH3CHO + O2 2CH3COOH 探究1：取血方法同上, 依次向14支試管內(nèi)各加0. 1mL血液后, 用加樣器再分別加入0.790g/mL無水乙醛5uL。來模擬人在大量飲酒后代謝在

21、血液中乙醛濃度對(duì)血紅細(xì)胞脆性影響。探究2：取血方法同上,依次向14支試管內(nèi)各加0.1mL血液后,用加樣器再分別加入0.05g/mL葡萄糖溶液10UL。來模擬人在大量攝入糖活著患有糖尿病后血液中高糖濃度對(duì)血紅細(xì)胞脆性影響。拓展探究表13 乙醛對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 試管標(biāo)號(hào)NaCl溶液濃度（mmol/L）OD值溶血率（%）11200.0637.221120.0788.831040.12514.44950.25128.95860.58967.86780.67477.67690.76986.38600.78288.69520.79190.210430.80792.911194001200.86910

22、02.4.2酒精、葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 表13 乙醛對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 試管標(biāo)號(hào)NaCl溶液濃度（mmol/L）OD值溶血率（%）11200.0637.221120.0788.831040.12514.44950.25128.95860.58967.86780.67477.67690.76986.38600.78288.69520.79190.210430.80792.911194001200.869100表14 葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響 試管標(biāo)號(hào)NaCl溶液濃度（mmol/L）OD值溶血率（%）11200.0758.421120.0788.631040.0819.14950.

23、19621.95860.33161.86780.64171.87690.68979.18600.77681.99520.7983.510430.79685.211194001200.8931002.4.3 結(jié)果分析在加入乙醛之后羊血紅細(xì)胞對(duì)低滲鹽溶液抵抗力略增高，紅細(xì)胞脆性減小。78mmol-118mmol的NaCl溶液內(nèi)紅細(xì)胞的溶血率比不加乙醛前降低5-12個(gè)百分點(diǎn),溶血程度降低明顯, 說明紅細(xì)胞破裂明顯減少。我們查閱相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞脆性下降的原因可能是乙醇分解后產(chǎn)生的乙醛濃度不斷增加對(duì)紅細(xì)胞膜的固化修飾所致4。此外，隨著血液中乙醛逐漸被分解,其對(duì)紅細(xì)胞的修飾作用解除,紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能

24、恢復(fù)正常;而且乙醇代謝的產(chǎn)物-乙酸濃度比例不斷上升可能會(huì)使紅細(xì)膜性增高,這兩種作用的協(xié)調(diào)將使得紅細(xì)胞脆性逐步恢復(fù)正常。參考文獻(xiàn)：4 郭希超,陳曉剛,陳瑜，等. 急性酒精中毒后紅細(xì)胞膜脆性檢查.臨床檢驗(yàn)雜志. 2001,19(3):186-188.由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，我們有設(shè)計(jì)了一組加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)，但做過之后思考發(fā)現(xiàn)，5%的葡萄糖溶液也常作為血漿等滲液使用。通常注射制劑的血漿等滲液的調(diào)配很重要，應(yīng)用NaCl當(dāng)量法,葡萄糖的NaCl當(dāng)量為0.185。加入葡萄糖，從某一角度講相當(dāng)于提高了NaCl低滲夜的濃度，無疑會(huì)產(chǎn)生紅細(xì)胞脆性減小的結(jié)果。不過可以大幅度提高葡萄糖濃度，來探究高糖環(huán)境對(duì)紅細(xì)胞脆性的影

25、響。有資料顯示6，高濃度葡萄糖會(huì)誘導(dǎo)的紅細(xì)胞磷脂酰絲氨酸暴露、滲透脆性增高和膜脂質(zhì)過氧化損傷。參考文獻(xiàn)：5 崔福德. 藥劑學(xué)（第五版）. 北京：人民衛(wèi)生出版社. 2007，9：455-4576 權(quán)國波, 韓穎, 楊超,等. 海藻糖抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的紅細(xì)胞磷脂酰絲氨酸暴露、滲透脆性增高和膜脂質(zhì)過氧化損傷的研究. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 2008; 16( 6): 1442- 1446在加樣中, 我們改用微量加樣器加樣, 加樣準(zhǔn)確消除了濃度誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。通過其溶血度變化從而證明用分光分度法可以用于臨床初步篩選對(duì)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定的藥品以及對(duì)紅細(xì)胞膜破壞的藥品, 對(duì)靜脈注射制劑新藥的安全性是一種安

26、全有效準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法。此外，我們還可以依據(jù)本實(shí)驗(yàn)，再加入維生素C（膳食、輔助性藥物）、乳酸（無氧運(yùn)動(dòng)）、血氨（人體正常數(shù)值不超過60umol/L）、甘油（注射用溶劑的一種）等物質(zhì)來探究因?yàn)轱嬍?、輸液、運(yùn)動(dòng)、疾病等原因?qū)е碌难涵h(huán)境改變對(duì)紅細(xì)胞脆性的影響。進(jìn)一步拓展三、染色中觀察到的小顆粒藍(lán)色聚集物是什么？猜想：1、制片問題？2、染液殘?jiān)?、紅細(xì)胞干擾？4、白細(xì)胞破裂釋放物質(zhì)？5、細(xì)菌？6、血液中其他物質(zhì)?1、制片問題？探究過程：我們最開始覺得這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因?yàn)椴僮鞑灰?guī)范，血片制的太厚，重新制薄片后觀察，又出現(xiàn)些許小顆粒聚集現(xiàn)象，猜測可能是染料殘留物或者是破碎的紅細(xì)胞。于是我們又重新做了

27、一遍，將制片洗完全，觀察，仍然在視野中發(fā)現(xiàn)少量聚集物，于是排除染料殘留的可能性。白細(xì)胞破裂？對(duì)于白細(xì)胞破裂的猜測，我們的想法是從血液中分離處理白細(xì)胞直接進(jìn)行染色，于是查閱文獻(xiàn)，找尋血液中分離白細(xì)胞的方法:1、簡單離心分離法：直接取樣血液于離心管中3000r/min離心分離10min，取上清液，做成血片，染色觀察； 2、Ficoll-泛影鈉（Ficoll-Hypaque）密度梯度及紅細(xì)胞裂解法，首先配制白細(xì)胞緩沖液，漢克斯液配置好。然后提取好白細(xì)胞后，使用對(duì)照的方法，對(duì)其中一組加不同濃度的低滲鹽溶液，或者加不等量的蒸餾水，將白細(xì)胞脹破。然后制片染色，顯微鏡下觀察，與對(duì)照組做對(duì)比，觀察是否有相同的

28、聚集現(xiàn)象。后來，由于實(shí)驗(yàn)室缺乏所需藥品，而且該法對(duì)無菌條件的要求嚴(yán)格，我們在進(jìn)行一半時(shí)不得不中途放棄，感到非常遺憾。但這將作為我們今后研究的課題，進(jìn)一步激發(fā)我們對(duì)血液細(xì)胞研究的興趣!繼續(xù)征程!四、染色方法的改進(jìn)1、瑞氏染色法的改進(jìn)常規(guī)組：瑞氏染色液3-5滴於血膜染色12min 后加蒸餾水6-8滴，2-3min 鏡檢分類。改進(jìn)組:血膜片在0.85%的生理鹽水溶液中浸泡1-1.5秒然后加入瑞氏染色液3-5滴染色10-15秒后用蒸餾水沖洗，鏡檢分類。鏡檢觀察改進(jìn)組染色片在鏡下偶見紅細(xì)胞淡影，白細(xì)胞染色良好。討論：優(yōu)點(diǎn)：本方法可以縮短染色時(shí)間。白細(xì)胞清晰地鋪在玻璃片上，偶見紅細(xì)胞淡影。改進(jìn)組主要是生理

29、鹽水傾溢血膜片上，在血膜外形成一層液態(tài)膜，阻止染色液與紅細(xì)胞直接接觸，延緩了紅細(xì)胞與染色液的結(jié)合。2、姬姆薩染色法改進(jìn)1、染液配制取分析純姬姆薩氏粉0. 5 g, 甘油2. 5 ml , 甲醇2. 5 ml。將姬姆薩氏粉置于乳缽, 研溶于少量甘油中, 再加入全部甘油, 傾于燒瓶內(nèi), 置60水浴2 h, 并不斷振搖攪拌, 促其完全溶解, 再加入甲醇混合過濾, 存放23 周后使用。臨用時(shí)取原液以中性蒸餾水或離子水作10 倍稀釋。2、抹片制作 血液制成推片,組織制成觸片或抹片,滲出液、分泌物和培養(yǎng)物視其黏稠度直接或加生理鹽水稀調(diào)制作涂片,干燥,火焰固定。3、加溫染色 滴加姬姆薩氏染色液覆蓋整個(gè)抹片,

30、在酒精燈外焰上方約10cm處徐徐擺動(dòng)玻片,溫染色0.5 min, 再自然染色3min,蒸餾水沖洗至不褪色時(shí),吸水紙吸干玻片。4、鏡檢觀察討論：1、染色速度快, 從染色到鏡檢僅需6 min; 2、染色效果好, 抹片染色清晰度高; 3、節(jié)省染料, 固定時(shí)不用甲醇, 避免了在染色缸內(nèi)浸泡抹片浪費(fèi)染色液的問題鏡下背景為淡紅色, 出現(xiàn)大量染成藍(lán)紫色的紅細(xì)胞！ 有異常現(xiàn)象！酒精燈固定后的血片3、血涂片的雙重染色法的改良原理：紅細(xì)胞呈淡紅色，中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色，含有大小不等的紫紅色顆粒。嗜酸性粒細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大均勻的嗜酸性顆粒，染成桔紅色，嗜堿性粒細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有嗜堿性顆粒，分布不均勻，大小不等，

31、染成藍(lán)紫色，單核細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)有嗜天青顆粒，胞質(zhì)呈灰藍(lán)色，淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈天藍(lán)色方法： 1、新鮮血涂片自然晾干 2、瑞氏染液染色5min蒸餾水沖洗數(shù)遍 3、0.05乙酸分色3s，蒸餾水沖洗兩遍 4、稀釋了的姬姆薩染液染色10min，蒸餾水沖洗數(shù)遍，吹干 5、無水酒精脫水15s左右鏡檢觀察討論：1、兩種染液分別進(jìn)行染色，避免了成電的產(chǎn)生，用0.05乙酸分色。2、血涂片直接用瑞氏染液固定節(jié)省時(shí)間，配制染液蒸餾水的pH值為6.77.0，但染液染色的順序不能顛倒數(shù)目極多的紅細(xì)胞，再次出現(xiàn)異常!紙上得來終覺淺絕知此事要躬行討論：三個(gè)白細(xì)胞染色法改良的實(shí)驗(yàn)中，只有第一個(gè)瑞氏的改良法是成功的，而從姬姆薩染色法的改進(jìn)和雙重染色法的改良我們可以看