研究?jī)?nèi)容與方法標(biāo)書(shū)撰寫(xiě)2016nov

1、標(biāo)書(shū)研究?jī)?nèi)容與研究方法撰寫(xiě)體會(huì)劉成海上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所Nov 17，2016題目等基本信息、項(xiàng)目組主要成員、經(jīng)費(fèi)預(yù)算報(bào)告正文 立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容立項(xiàng)依據(jù)研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)、以及解決關(guān)鍵問(wèn)題擬采用的研究方案及可行性分析特色與創(chuàng)新年度計(jì)劃與預(yù)期結(jié)果研究條件與工作基礎(chǔ)國(guó)家自然科學(xué)基金等2# 為何要做？1# 做什么？4 # 能不能做？3# 怎樣做？國(guó)家自然科學(xué)基金同行評(píng)議意見(jiàn)表3# 怎樣做？注意重復(fù)“主動(dòng)”檢索內(nèi)容與方法 容易出現(xiàn) 可疑“重復(fù)”與既往課題組有銜接內(nèi)容、相似方法重復(fù)與他人的內(nèi)容方法重復(fù)判斷少數(shù)：真的重復(fù)，抄襲、一稿多投部分：延續(xù)性?xún)?nèi)容、相似方法 雖然文字重復(fù)，但實(shí)質(zhì)內(nèi)容異部分：檢測(cè)

2、重復(fù)比例低，但實(shí)質(zhì)性重復(fù)2. 項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)、 以及解決關(guān)鍵問(wèn)題（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）要求: 研究?jī)?nèi)容 合適、研究目標(biāo) 突出、以及解決關(guān)鍵問(wèn)題 準(zhǔn)確不同寫(xiě)法1# 問(wèn)題導(dǎo)向：一個(gè)問(wèn)題下面，一塊目的與內(nèi)容。表述很細(xì)，而第3部分- “研究方案”則集中于技術(shù)方法，表述簡(jiǎn)單。2# 思路導(dǎo)向：總體研究思路 內(nèi)容目標(biāo) 歸納“關(guān)鍵問(wèn)題” 。常有重疊交叉?！胺o(wú)常法”，思路 與 問(wèn)題 要理清楚哪里去找思路 Good Idea ？實(shí)際是“選題”人的正確思想是從那里來(lái)的？是天上掉下來(lái)的嗎？ 不是。是頭腦里固有的嗎？也不是。人的正確思想只能從社會(huì)實(shí)踐中來(lái)，只能從社會(huì)的生產(chǎn)斗爭(zhēng)、階級(jí)斗爭(zhēng)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)這三項(xiàng)實(shí)踐

3、中來(lái)。 -毛澤東學(xué)而不思則罔；思而不學(xué)則殆。-孔子好的選題是成功一半Idea觀(guān)點(diǎn)思路賣(mài)點(diǎn)（Selling points） ，如何做成一個(gè)出色的 Grant，賣(mài)給 Reviewers ？Why should you give me the money?闡明發(fā)病 / 藥理機(jī)制的理論價(jià)值潛在臨床意義和應(yīng)用價(jià)值-基礎(chǔ)（科研）應(yīng)用（臨床）論文病人（產(chǎn)品）理論技術(shù)應(yīng)用于具體病人問(wèn)題/樣本/信息 分析研究中醫(yī) 內(nèi)涵現(xiàn)代 技術(shù)通用 規(guī)范科研與臨床的協(xié)調(diào)發(fā)展以中醫(yī)理論為指導(dǎo)以臨床療效為基礎(chǔ)以實(shí)踐轉(zhuǎn)化為導(dǎo)向注意從實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)“問(wèn)題”、獲得“思路”應(yīng)用基礎(chǔ)舉例消脹貼膏制劑對(duì)肝硬化腹水的作用評(píng)價(jià)肝硬化腹水患者試驗(yàn)組(4

4、9)對(duì)照組(50)基礎(chǔ)治療（利尿藥限制使用）+ 安慰劑，敷臍，1天1次基礎(chǔ)治療（利尿藥限制使用）+ 消脹貼膏，敷臍，1天1次特點(diǎn)效應(yīng)如何發(fā)揮？ 臨床現(xiàn)象：消脹巴布劑輔助治療肝腹水時(shí)多具有排氣增多、腹脹減輕、納食增加等胃腸動(dòng)力反應(yīng)。思考：如何“氣行則水行”，外用藥物行氣以利水？-在于調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，降低腹內(nèi)壓，提高腎灌注壓，增加腎血流量。透皮效應(yīng)物質(zhì)及其代謝特征？“(商陸)治腫滿(mǎn)、小便不利者，以赤根搗爛，入麝香三分，貼于臍心，以帛束之，得小便利即腫消”2015基于胃腸動(dòng)力改變探討消脹貼治療肝硬化腹水的作用機(jī)制 /2016 中藥2.1 研究?jī)?nèi)容告訴讀者專(zhuān)家 您要做什么？建議先簡(jiǎn)述一下總體工作思路，尤

5、其是精心推敲出一個(gè)“思路示意圖”基于 XX 進(jìn)展/問(wèn)題/前期工作，提出 XX 假說(shuō)，通過(guò) 如圖所示工作，達(dá)到XX目的研究?jī)?nèi)容 則按圖說(shuō)話(huà)，分段表述例：2005丹酚酸B影響TGF-受體與Smads蛋白功能的抗肝纖維化作用機(jī)制HSC/動(dòng)物肝臟TGF-1刺激TGF-受體(I/II)蛋白與基因表達(dá)結(jié)合功能(Bmax, Kd, IC50, KI, 親和標(biāo)記)TR-I胞內(nèi)激酶活性胞內(nèi)信號(hào)分子(R-,Co-,I-)Smads表達(dá)R-Smads磷酸化核轉(zhuǎn)位DNA結(jié)合活性生物效應(yīng)PAI-1蛋白與基因表達(dá)膠原蛋白與基因表達(dá)HSC活化（-SMA表達(dá)）肝纖維化（膠原沉積）丹酚酸BTR-IINPC-34016干 預(yù)總體

6、工作思路示意圖【研究?jī)?nèi)容】 在既往丹酚酸B抗肝纖維化臨床療效與拮抗TGF-1促肝星狀細(xì)胞膠原基因表達(dá)的工作基礎(chǔ)上，緊密?chē)@TGF-1促肝星狀細(xì)胞活化與肝纖維化的關(guān)鍵病理機(jī)制，針對(duì)TGF1TRSmads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能作用，進(jìn)一步探討丹酚酸B影響TGF-受體與胞內(nèi)Smads信號(hào)分子功能的抗肝纖維化關(guān)鍵作用機(jī)制。 1 肝纖維化過(guò)程中模型大鼠肝組織TR及Smads蛋白的表達(dá)與活化特點(diǎn)，丹酚酸B預(yù)防與治療用藥對(duì)纖維化肝臟TR及Smads蛋白表達(dá)與活化的干預(yù)作用。 復(fù)制大鼠肝纖維化模型，以丹酚酸B預(yù)防與治療給藥，以可溶性TR-II受體為對(duì)照，動(dòng)態(tài)觀(guān)察纖維化肝組織TGF-1及其I、II型受體表達(dá)，Smads

7、蛋白表達(dá)、磷酸化及與DNA結(jié)合活性的變化，探討肝纖維化形成過(guò)程中肝組織Smads蛋白表達(dá)與活性的變化特點(diǎn)，丹酚酸B影響纖維化肝臟TGF-受體與Smads蛋白表達(dá)活性的抗肝纖維化作用機(jī)制。 2 丹酚酸B對(duì)HSC內(nèi)源性與TGF-1刺激后TGF-受體與Smads蛋白表達(dá)與功能的影響。 分離并原代培養(yǎng)大鼠HSC，以TGF-1刺激，丹酚酸B干預(yù)，并以可溶性受體或受體胞內(nèi)激酶抑制物為對(duì)照，觀(guān)察普通培養(yǎng)HSC與TGF-1刺激HSC中TGF-受體蛋白與基因表達(dá)、TR-I胞內(nèi)激酶磷酸化及受體結(jié)合功能，Smads蛋白表達(dá)、磷酸化、核轉(zhuǎn)位與DNA結(jié)合的活性，及細(xì)胞活化等生物學(xué)效應(yīng)變化，探討丹酚酸B干預(yù)TGF-1細(xì)胞

8、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要作用環(huán)節(jié)與特點(diǎn)。研究?jī)?nèi)容 要 合適針對(duì)研究目的（假說(shuō)）決定研究?jī)?nèi)容；小心求證， 小題大做，深做， 不要大題小做，淺做，處理“深入”與“全面”的矛盾避免研究?jī)?nèi)容不足以得到預(yù)定目的（小于，少于）避免研究?jī)?nèi)容超越預(yù)定目的（大于，多于）2.2 研究目標(biāo) （要突出）告訴 您要 獲得的結(jié)果/目的- Goal與研究?jī)?nèi)容相對(duì)應(yīng)，每個(gè)階段性、具體的目標(biāo)發(fā)現(xiàn)、明確、闡明、詮釋、建立-【研究目標(biāo)】 探討大鼠肝纖維化形成過(guò)程中肝臟Smads蛋白表達(dá)與活性變化特點(diǎn)，明確丹酚酸B體內(nèi)預(yù)防與治療用藥對(duì)纖維化肝組織TGF-受體與Smads蛋白表達(dá)與活性的干預(yù)作用。 著重探討丹酚酸B對(duì)TGF-1刺激肝星狀細(xì)胞中T

9、GF-受體表達(dá)與結(jié)合功能、胞內(nèi)Smads蛋白表達(dá)、磷酸化、核轉(zhuǎn)位及與DNA結(jié)合活性水平等的影響，明確丹酚酸B抗肝纖維化的關(guān)鍵分子藥理機(jī)制，促進(jìn)藥物的臨床應(yīng)用，提高對(duì)肝纖維化病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，提高抗肝纖維化藥理研究水平。2.3 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題 （要準(zhǔn)確）選題 時(shí)關(guān)鍵思考（思路）所在；完成本研究在理論上和技術(shù)上的“瓶頸”所在；獲取針對(duì)科學(xué)假說(shuō)的關(guān)鍵證據(jù)，是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之核心沒(méi)有問(wèn)題 是 最大的問(wèn)題！常見(jiàn)誤區(qū)：將技術(shù)手段或?qū)嵤┻^(guò)程視為科學(xué)問(wèn)題，如收集樣本與采集信息、PCR、模型建立、某種活性成分檢測(cè)等。 【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 TGF-受體放射性分析方法的建立，及丹酚酸B對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-受體結(jié)合功

10、能的影響。 丹酚酸B對(duì)肝星狀細(xì)胞與纖維化肝組織R-Smads尤其是Smad3活性功能的影響，及其與Smad7表達(dá)變化的關(guān)系。 丹酚酸B干預(yù)TGF-1TRSmads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以抗肝纖維化的主要作用環(huán)節(jié)。關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題蟲(chóng)草能否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫/NK而發(fā)揮抗肝纖維化作用？分子細(xì)胞藥理機(jī)制如何？主要效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)？蟲(chóng)草（菌絲）在纖維化疾病、肝損傷中廣泛應(yīng)用，療效確切；蟲(chóng)草具有明顯的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用；細(xì)胞免疫與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與消退痊愈有明顯關(guān)系。 舉例 2011蟲(chóng)草菌絲調(diào)節(jié)NK功能的抗肝纖維化免疫機(jī)制與關(guān)鍵物質(zhì)立項(xiàng)依據(jù)總體思路關(guān)鍵問(wèn)題問(wèn)題？思路？選題？我追尋我所得不到的，我得到了我所不追尋的。-泰戈?duì)?/p>

11、有心栽花花不開(kāi)，無(wú)心插柳柳成蔭-增廣賢文無(wú)意中發(fā)現(xiàn)：丹參優(yōu)于蟲(chóng)草（補(bǔ)益）；那么：活血化瘀中藥 也有很好免疫調(diào)節(jié)？舉例 2016 基于PD-L1/PD-1信號(hào)通路研究丹參調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞功能抗肝纖維化的作用機(jī)制3. 擬采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技術(shù)路線(xiàn)、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明)研究方案告訴評(píng)委您 打算怎么做？緊扣 研究?jī)?nèi)容 設(shè)計(jì)方案，根據(jù)方案選擇方法。分類(lèi)分部進(jìn)行方案合理可行， 方法有所創(chuàng)新Control! Control! Control!多方法 / 多方面 / 多層次; 少平面 順序可先粗后精，先易后難，藥效機(jī)制。每一個(gè)部分（方案1/2/3-），建議有主題，“技術(shù)路線(xiàn)”先行

12、，而后看圖說(shuō)話(huà)技術(shù)性建議材料 （清楚）藥物：規(guī)范名稱(chēng)、組成與劑量、來(lái)源等中藥質(zhì)控：基元品種、鑒定、制備、標(biāo)準(zhǔn)制劑等關(guān)鍵抗體、探針：來(lái)源、特性等模型制備與分組 （順序與構(gòu)成清晰）適當(dāng)圖表，加強(qiáng)表述主要觀(guān)察指標(biāo)與方法指標(biāo)精要，不要平面堆砌一般方法: 關(guān)鍵要素，不要“試劑盒方法”/“教科書(shū)式”關(guān)鍵方法: 詳細(xì)描述，引證文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析 （規(guī)范 正確）數(shù)據(jù)處理方法及標(biāo)準(zhǔn)、的統(tǒng)計(jì)工具及軟件名稱(chēng)舉例 中藥（方）來(lái)源及其質(zhì)量控制藥物中藥復(fù)方的組成: 藥物、(植物)來(lái)源、藥用部位、劑量等中藥復(fù)方的質(zhì)量控制：主要制備工藝、主要成分指紋圖譜等單味藥物質(zhì)量控制：藥物來(lái)源、主要成分及其含量等Example 1. T

13、he formula of FZHY (扶正化瘀方，one dose)Chinese name Plant sources Medicinal partsAmount in preparation (g)Danshen(丹參)Salvia Miltiorrhizae Bge. (Labiatae)radix8Chongcaoartifical fermentation cordycepsmycelia4TaorenPrunus persica (L.) Batsch(Rosaceae)fruit2JiaogulanGynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

14、(Cucurbitaceae)whole herb6SonghuafenPinus massoniana Lamb.(Pinaceae)pollen2WuweiziSchisandrae Chinensis (Turcz.) Baill.(Magnoliaceae)fruit2Example 2. 復(fù)方中成藥的質(zhì)量控制 Fig.X. The chromatographic prole of FZHY extracts Stationary phase: CNW Athena C18-WP(4.6mm150mm, 3m), ow rate:1 mL/min). Peak No.: 1. dans

15、hensu; 2. protocatechuic aldehyde; 3. rosmarinic acid 4. salvianolic acid B; 5. schizandrol A; 6. schizandrol B; 7. schizandrin A; 8. uridine 9. guanosine; 10. adenosine.To control the FZHY extracts quality, the fingerprint spectrum was established by high performance liquid chromatography (HPLC) me

16、thod. The chromatographic prole of the extracts was shown in Fig. 1. The contents of adenosine and danshensu were respectively 2.5mg/g and 8.04mg/gThe ratios of dry extract 12.85%舉例 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 分組圖示組別 培養(yǎng)系 正常細(xì)胞 TGF-1刺激細(xì)胞空白對(duì)照組M199M199100 pM TGF-1藥物對(duì)照組TR-IIM199 + TR-IIM199 100 pM TGF-1+ TR-II藥物對(duì)照組34016M1

17、99NPC-34016M199100 pM TGF-1NPC-34016丹酚酸B 1mol/L組M1991M丹酚酸BM199100pM TGF-11M丹酚酸B丹酚酸B 10mol/L組M19910M丹酚酸BM199100pM TGF-110M丹酚酸B表1. 丹酚酸B體外藥理實(shí)驗(yàn)分組示意圖關(guān)鍵技術(shù)方法 詳細(xì)描述！主要觀(guān)察指標(biāo)與方法參考文獻(xiàn)Ala-Kokko L, Pihlajaemi T, Myers J. Gene expression of type I, III and IV collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitroami

18、ne in the rat. Biochem J, 1987; 244: 75-79.（動(dòng)物模型制備方法）胡義揚(yáng), 劉 平, 劉 成, 等. 丹參提取物對(duì)CCl4和DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的影響， 上海中醫(yī)藥雜志，1999; 10: 710.（整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)丹酚酸B用量）George J, Roulot D, Koteliansky VE, et al. In vivo inhibition of rat stellate cell activation by soluble transforming growth factor type II receptor: a potential new

19、 therapy for hepatic fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96(22): 12719-12724 （TR-II體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的劑量與用法）Dooley S, Delvoux B, Lahme B, et al. Modulation of transforming growth factor response and signaling during transdifferentiation of rat hepatic stellate cells to myofibroblasts. Hepatology, 2000; 31:1

20、094-1106.（Smads的DNA結(jié)合活性分析方法及SBE寡核苷酸探針序列）劉成海，劉 平，胡義揚(yáng)，等. 丹酚酸B鹽對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1刺激肝星狀細(xì)胞活化與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（18）：12671272.（細(xì)胞模型、體外實(shí)驗(yàn)丹酚酸B劑量、TGF-1用量）Liu C, Gaca MDA. Swenson S, et al. Smads 2 and 3 are differentially activated by TGF- in quiescent and activated hepatic stellate cells: J Biol Chem; 2003；278

21、 (13): 11721-11728.（TGF-1刺激濃度，NPC 34016用量與用法）Friedman SL, Yamasak G, Wong L. Modulation of transforming growth factor receptors of rat lipocytes during the hepatic wound healing response: enhanced binding and reduced gene expression pany cellular activation in culture and in vivo. J Biol Chem, 1994;

22、269: 10551-10558（TGF-受體的放射性實(shí)驗(yàn)相關(guān)方法）舉例 研究方案的方法學(xué)文獻(xiàn)引證例 研究方案(免疫相關(guān)題 ) 實(shí)驗(yàn)一：探討乙肝早期肝硬化患者有效抗病毒治療后肝纖維化差異應(yīng)答的肝臟NK細(xì)胞與HSC病理變化特征先 技術(shù)路線(xiàn)再逐步描述樣本來(lái)源與分組：試驗(yàn)結(jié)束揭盲后，選用本項(xiàng)目上海地區(qū)三家臨床分中心XX樣本。-主要觀(guān)察指標(biāo)與方法肝組織NK細(xì)胞的數(shù)量及其抑制型與活化型受體表達(dá)：選擇NK細(xì)胞表面抑制型受體NKG2A、活化型受體NKp46、NKp44以及負(fù)性調(diào)節(jié)因子PD-1，采用免疫組化染色（Envision兩步法）。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.6% H2O2甲醇液清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.

23、2%胰蛋白酶消化，0.2%小牛血清白蛋白封閉，分別滴加上述抗體，37溫育1h，滴加二抗（HRP標(biāo)記抗小鼠抗體，購(gòu)自Antibody Diagnostic 公司），37溫育30min，AEC顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片?？瞻讓?duì)照以PBS代替特異性抗體。陽(yáng)性染色結(jié)果采用病理數(shù)字圖像分析，半定量（下同）。肝組織HSC的凋亡：免疫熒光共染，TUNEL染色示細(xì)胞凋亡，desmin染色示HSC，激光共聚焦顯微鏡拍片。-統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分別進(jìn)行治療前基線(xiàn)比較、同組治療前后比較、治療后組間比較等。SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，GraphPad Prism 5.0軟件作圖。計(jì)量資料以“均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差”表

24、示，組間差別采用單因素方差分析，LSD進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料采用Ridit分析；NK細(xì)胞NKp46、NKp44、PD-1、NKG2A表達(dá)與Ishak評(píng)分及-SMA、TUNEL、PD-L1與MICA/B等免疫組化染色半定量結(jié)果之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳細(xì)簡(jiǎn)約詳細(xì)可行性分析理論原理/研究進(jìn)展前期工作人員組成 (結(jié)構(gòu)) 技術(shù)與設(shè)備設(shè)施【可行性分析】丹酚酸B有良好的抗肝纖維化臨床效果，在多種肝纖維化動(dòng)物模型中也被證實(shí)有良好的抗肝纖維化作用。已明確TGF-1TRSmads的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)，我們前期工作及國(guó)內(nèi)外同行研究結(jié)果已基本了解-我們前期工作已發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可拮

25、抗TGF-1刺激的HSC膠原基因表達(dá)等促活化作用，并抑制其胞內(nèi)Smad2磷酸化。-推測(cè)-。項(xiàng)目組成人員結(jié)構(gòu)合理，年富力強(qiáng)。申請(qǐng)人與主要成員長(zhǎng)期從事相關(guān)領(lǐng)域研究，熟悉該課題的國(guó)際前沿理論進(jìn)展，掌握動(dòng)物模型與細(xì)胞分類(lèi)培養(yǎng) - 等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。125I-TGF-1與各種抗體可購(gòu)買(mǎi)，所需丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品與相關(guān)基因檢測(cè)探針的質(zhì)粒已具備。研究場(chǎng)所與條件優(yōu)良，且與中科院上海藥物所 - 等單位有長(zhǎng)期良好的協(xié)作關(guān)系。4. 特色與創(chuàng)新可分 可合提煉創(chuàng)新點(diǎn)謹(jǐn)慎 “首創(chuàng)”【特色】結(jié)合肝纖維化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子病理機(jī)制的國(guó)際最新研究進(jìn)展，采用相關(guān)先進(jìn)技術(shù)方法，研究我國(guó)傳統(tǒng)中藥（丹參）有效成分丹酚酸B抗肝纖維化的主要分子藥理機(jī)制。受體(TR)功能、下游信號(hào)分子活性及其生物效應(yīng)相結(jié)合，培養(yǎng)細(xì)胞與整體動(dòng)物模型