2015年第09講+冷凍電鏡技術(shù)

1、1Cryoelelctron Microscopy 第九講 冷凍電鏡技術(shù)楊永亮2015年2生物電子顯微術(shù)的發(fā)展50s Hall, Huxley, Brener 發(fā)明了負(fù)染技術(shù);研究了生物材料。-分辨率2 nm。60s Klug 提出電子顯微圖像的三維重構(gòu)理論;解析了煙草花葉病毒的結(jié)構(gòu)。-1982 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。70s Henderson, Uniwin 建立了電子晶體學(xué);解析了膜蛋白bacteriorhodopsin的結(jié)構(gòu)。-分辨率0.7 nm.80s Adrian & Dubochet 發(fā)明了快速冷凍技術(shù)- 冷凍電子顯微術(shù)誕生。-分辨率0.2 nm.3負(fù)染法：用重金屬染料堆積在分子周圍，反襯

2、出分子結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)：襯度大，易于觀察缺點(diǎn)：染料顆粒較大，不能滲入分子內(nèi)部所的結(jié)構(gòu)是分子的外部形貌樣品脫水分子變形分辨率低一般用于樣品中分子數(shù)量和質(zhì)量的初步觀察負(fù)染法4是將樣品的背景染色以突顯樣品，本身不會(huì)顯示任何結(jié)構(gòu) 5樣品包埋處理冰凍法將樣品快速的冷凍在玻璃態(tài)的冰中優(yōu)點(diǎn)：樣品含水處于天然狀態(tài)結(jié)構(gòu)為真實(shí)結(jié)構(gòu)分辨率高，0.2 nm缺點(diǎn)： 襯度低不易觀察用于樣品結(jié)構(gòu)的高分辨分析及動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)分析6冷凍電子顯微術(shù)（cryo-electron microscopy)主要步驟樣品冷凍，將樣品快速包埋在玻璃態(tài)冰中樣品轉(zhuǎn)移，將樣品轉(zhuǎn)移到液氮或液氦冷卻的低溫冷臺(tái)中樣品觀測(cè)及圖像采集，在液氮或液氦溫度進(jìn)行7如何冷凍包埋

3、樣品？150 一是將樣品在載網(wǎng)上形成一薄層水膜；二是將第一步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍8冷凍包埋的質(zhì)量控制ABCDA: 分布不均B: 樣品污染C:理想樣品1. 分布均勻2. 沒(méi)有重疊3. 厚度均一D: 厚度不均9Principles of Electron-microscopy10冷凍電鏡在房間內(nèi)的安裝11中科院生物物理所有一臺(tái)清華有三臺(tái)12電子劑量對(duì)圖像質(zhì)量的影響10e/220e/230e/240e/210e/220e/230e/240e/213電鏡觀測(cè)和記錄由于樣品在輻射下產(chǎn)生損傷，觀測(cè)時(shí)須采用低劑量技術(shù)（low dose technique)一般控制電子劑量 10 e/2低劑量技術(shù)尋找在

4、低倍下進(jìn)行 （1-3k）聚焦在照像區(qū)域的相鄰區(qū)域進(jìn)行 （100-300k)記錄區(qū)域僅在照相時(shí)受到輻射 （30-60k)14離焦量對(duì)信息傳遞的影響15電鏡與三維圖像重構(gòu)16Electron MicroscopyWhy do we need 3D information?3D objectprojection2D photoDrawing by John OBrien, The New Yorker Magazine (1991)17三維圖像重構(gòu)在電鏡下觀察樣品時(shí)，所看到的是樣品在垂直于電子束方向的投影（二維信息）要得到樣品的三維結(jié)構(gòu)，須將投影信息（二維信息）轉(zhuǎn)變?yōu)槿S信息將二維信息組合得到三維信

5、息并得到三維結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為三維圖像重構(gòu)18The principle of 3D reconstruction三維物體二維投影二維投影的傅立葉變換三維傅立葉變換三維結(jié)構(gòu)反傅立葉變換 Klug A, De Rosier DJ. Nature (1966), 212:29-32.19The effect of sampling18 Proj. / 10 deg.36 Proj. / 5 deg.72 Proj. / 2.5 deg.20電子斷層技術(shù)(tomography)電子斷層技術(shù)實(shí)際上是最為廣泛應(yīng)用的獲取三維結(jié)構(gòu)的方法。它通過(guò)重構(gòu)一系列一定傾斜角度樣品的二位投影來(lái)獲取三維圖像。樣品或者光源與檢

6、測(cè)器總的傾斜角度越大，而每次的增量越小，則獲取的信息越多，重構(gòu)圖像的質(zhì)量也就越高。21生物電鏡三維重構(gòu)方法方法研究對(duì)象 對(duì)象特點(diǎn) 分辨率電子晶體學(xué) 1. 二維晶體 周期排列 0.19 nm 2. 管狀晶體 0.40 nm單顆粒技術(shù) 1. 病毒 全同粒子 0.38 nm 2. 大分子復(fù)合體 0.40 nm斷層成像術(shù) 1.細(xì)胞器，細(xì)胞 單一結(jié)構(gòu) 4.0 nm2. 組織切片22冷凍電子顯微術(shù)及三維重構(gòu)技術(shù)的應(yīng)用23Three-dimensional Structure determination 24The Structure of BacteriorhodopsinEM: yellowX-ray:

7、 purple2526AchR的三維結(jié)構(gòu)(Miyazawa et al, Nature 423, 949, 2003)Side viewTop viewTransmembrane 27簡(jiǎn)單到復(fù)雜Study complex structure28Brcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of Sciences29Structural model of the coronavirion based on tomogramsBrcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by N

8、ational Academy of Sciences30HIV對(duì)宿主的感染31J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159=spikes32J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature071593D structure of the HIV-1 spike in complex with CD4 and 17b-Fab.33J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159Conforma

9、tional change in the gp120 trimerinduced by CD4 binding34Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of Sciences35Distributions and shape-based differentiation of HA and NA spikesHarris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesHA=neuraminidaseNA=ribonucleaprotein36離體到在體Study the structure of cell and tissue37Science ( 2002) 298:1209-1212Resolution: -5 nmThickness of the region observed: 200-350nmDictyostelium cells (網(wǎng)柄菌細(xì)胞)38組織的三維結(jié)構(gòu)髓鞘的三維結(jié)構(gòu)39冷凍電鏡FEI F30 300kV FEG electron microscopeGatan US4000 4kx4k CCD cameraGa