免疫組化相關(guān)步驟

1、免疫組化操作步驟、儀器設(shè)備18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.水浴鍋、試劑PBS緩沖液(ph7.27.4)：NaC137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L.0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,ph6.0,1000ml)：檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。0.5mol/LEDTA緩沖液(ph8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O，用10mmol/LNaOH調(diào)至ph8.0,加水至1000ml.1mol/L的TBS緩沖液(ph8.0)：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至ph

2、8.0,加水1000ml。酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。3%甲醇一H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制風裱劑：a.甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(ph9.0-9.5)等量混合b油和TBS(PBS)配制TBS/PBSPH9.0-9.5,適用于熒光纖維鏡標本;ph7.0-7.4適合光學纖維標本、操作流程1、脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60C恒溫箱中烘烤20分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘b無水乙醇中浸泡五分鐘c95%乙醇中浸泡五

3、分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘2、抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：A抗原熱修復a高壓熱修復在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。b沸熱修復電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至95C左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。c微波爐加熱在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，

4、間隔5-10分鐘，反復1-2次。適用的抗原Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb等B酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37C，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫組化染色

5、SP法脫蠟、水化PBS洗2-3次各5分鐘3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘PBS洗2-3次各5分鐘抗原修復PBS洗2-3次各5分鐘滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體滴加I抗50卩1,室溫靜置1小時或4C過夜或37C1小時4C過夜后需在37C復溫45分鐘PBS洗3次每次2分鐘滴加II抗45-50卩1，室溫靜置或37C1小時II抗中可加入0.05%的tween-20.PBS洗3次各5分鐘DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度PBS或自來水沖洗10分鐘蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化(17)自來水沖洗10-15分鐘(18)脫水、透明、封片、鏡檢。4、SA

6、BC法脫蠟、水化(2)PBS洗2次各5分鐘用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次抗原修復PBS洗5分鐘滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體滴加I抗50卩1,室溫靜置1小時或4C過夜或37C1小時PBS洗3次各2分鐘滴加生物素化II抗，20C-37C20分鐘PBS洗3次各2分鐘(11)滴加試劑SABC20C-30C20分鐘PBS洗4次各5分鐘DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化問題解答1、染色過強a抗體濃度過高或孵育時間過長降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜b孵育溫度過高超過37度一般在室溫20-度2

7、8顯色時間過長或濃度過高顯色時間不超過分鐘，以顯微鏡下觀察為準2非特異性背景染色操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗次每次分鐘組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮封閉孵育時間延長c組織中含內(nèi)原性生物素正常非免疫動物血清再封閉d血清蛋白封閉不充分延長血清蛋白封閉時間3、染色弱a抗體濃度過低、孵育時間過短提高抗體濃度、孵育時間不能少于60分鐘b試劑超過有效使用時間應更換試劑c操作中添加試劑時緩沖液未瀝干每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋(應防止切片干燥)d室溫太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-分6鐘0或4度冰箱過夜e蛋白封閉過度封閉不要超過12分鐘4、染色陰性a操作步驟錯誤應重試設(shè)陽

8、性對照b組織中無抗原設(shè)陽性對照以驗證試驗結(jié)果c一抗與二抗種屬連接錯誤仔細確定一抗二抗種屬無誤免疫組化操作要點及技巧固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。固定液：飽和苦味酸，甲醛，冰醋酸，其對組織的穿透力較強，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。液：即高碘酸鈉賴氨酸多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片

9、，切不完整。操切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌２伲ǎ┛酒?分鐘或7過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。（）蠟塊及切片的保存：最好在C保存（）脫片問題：多聚賴氨酸為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，的多聚賴氨酸溶液可按稀釋成的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（和）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在：丙酮溶液中浸泡分鐘，晾干，即可進行下一步。（）滅活內(nèi)源性酶：系統(tǒng)：雙氧水滅活；系統(tǒng)：滅活。（8）暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，

10、這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度（不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書）。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。（）封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉（）抗體稀釋：應遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于稀釋的抗體一定要當天使用。（）背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含。的洗，特別是在顯色之前要多洗。（2返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如）或的飽和溶液返藍。（3顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

11、（）在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。（5拍照：）更換樣品時，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。2）數(shù)碼相機必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機的自動白平衡功能給關(guān)掉3）免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應在25左0右。如果呈現(xiàn)淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使

12、燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題：.組織處理恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細胞材料準備的過程中，不僅要求保持組織細胞形態(tài)完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。：）組織及時取材和固定組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應盡快的進行取材，最好內(nèi)，取材時所用的刀應銳利，要一

13、刀下去切開組織，不可反復切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在xx,切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，也就是說組織塊的面積可以大到X，但組織塊的厚度千萬不能超過，否則將不利于組織的均勻固定。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。對于固定液的選擇，原則上講，應根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進行免疫組化的染色，而染色的常規(guī)組織處理是采用：0的%中性緩沖福爾馬林或）%緩沖多聚甲醛）倍于組織體積進行組織固定，利

14、用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間最好在內(nèi)，一般固定時間不應超過小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。2）組織脫水、透明、浸蠟組織經(jīng)固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織無水酒精脫水h次，二甲苯透明h次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過C。切片組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理，由于我們

15、檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。多聚左旋賴氨酸一般采用分子量300左0右0的0.5多%聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在0溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應用，粘貼效果最好，但價格稍貴。2）明膠硫酸鉻鉀法將明膠加熱溶于蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入硫酸鉻鉀攪勻充分

16、溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中i取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意,如果液體變藍或粘稠狀停用。氨丙基乙氧基甲硅烷此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入丙酮稀釋的中，浸泡，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為Mm切好的切片在0溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標記定位彌漫現(xiàn)象。免疫組化染色免疫組

17、化染色試劑盒采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細胞和組織中的抗原。免疫組化染色步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，用沖洗三次，每次分鐘3。根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。每張切片加滴或過氧化酶阻斷溶液試劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或的非免疫性動物血清試劑，室溫下孵育分鐘。甩去血清，每張切片加滴或的第一抗體用戶自選，室溫下孵育分鐘或。c過夜，建議參閱每種抗體的說明書。沖洗x5。甩去液，每張切片加滴或生物素標記的第二抗體（試劑），室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或鏈霉菌抗生物素過氧

18、化物酶溶液試劑，室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或新鮮配制的或溶液，顯微鏡下觀察分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。自來水沖洗，蘇木素復染，分化，氨水或沖洗返藍。如果用顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；如果用顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。蠟免疫組化染色注意事項蠟蠟蠟免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實際工作中不斷摸索和探討的事，但最基本的應從以下方面加以注意：蠟（1）去除內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素蠟一般我們進行免疫組化標記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內(nèi)源酶和內(nèi)源

19、性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標記抗體的，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標記抗體的過氧化酶進人組織切片之前就應設(shè)法將組織內(nèi)的內(nèi)源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進行。蠟1，去蠟除內(nèi)源酶蠟常用的去除內(nèi)源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細胞的標本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫反應，出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，易對組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)產(chǎn)生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內(nèi)源性酶，即使有些血細胞在顯色后也出現(xiàn)棕黃色反應，但由于其形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織細

20、胞不同，也易鑒別，而且此方法比較通用易操作，但應注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為一時間不宜過長，最好室溫。去除內(nèi)源性生物素在正常組織細胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合卵白素，形成卵白素一生物素復合物，導致假陽性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進行0.0卵1白%素溶液室溫處理，使其結(jié)合位點飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。3）滅活堿性磷酸酶最常用的方法是將左旋咪挫以每毫升加加入底物液中并保持值為，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用酒石酸抑制。（2）抑制非特異性背景著色非特異性著色最常見的情況

21、是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結(jié)締組織成分上，而出現(xiàn)背景著色，為了防止這種現(xiàn)象，最好用特異性抗體來源的同種動物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進行處理，以封閉荷電點，不讓一抗與之結(jié)合，但這種方法一般實驗室很難實現(xiàn)，一般常見實用的血清是羊血清或牛血清白蛋白在室溫下作用即可，但應注意此種結(jié)合是不牢固結(jié)合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對于多克隆抗體來講，易產(chǎn)生背景著色，在稀釋特異性抗體時可采用含非免疫血清的的液。（）緩沖液免疫組化染色標記是對生物體組織抗原進行標記，抗原抗體最適合的值為，最常用的是磷酸緩沖液簡易配法：蒸餾水中分別加入、。但如果是采用堿性磷酸酶作為標記物底物的方法時可

22、以用緩沖液比較好。C）抗原修復經(jīng)甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低，這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時，有些抗原需先進行修復或暴露?？乖迯头椒煞譃榛瘜W方法和物理方法?；瘜W方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時，浸泡切片的緩沖液的離子強度和值、加熱的溫度和時間均影響著抗原修復效果。目前最常用的修復方法有如下凡種：1胰蛋白酶主要用于細胞內(nèi)抗原的修復。一般使用濃度為，7作用。配法：胰蛋白酶加入到無水水溶液中溶解后即可。）胃蛋

23、白酶主要用于細胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復。一般濃度為，7作用。配法：胃蛋白酶溶于水溶液中。）熱引導的抗原決定簇修復，對大多數(shù)的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，最常用的抗原修復液是的枸櫞酸緩沖液和的緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現(xiàn)的?？乖迯鸵旱闹捣浅Ｖ匾行У目乖迯椭狄刃迯鸵旱幕瘜W成分更重要，同樣的修復液隨著值的升高染色的強度逐漸增強，但最佳值范圍為，對于大多數(shù)抗原這個范圍的值都能進行有效的修復，有些抗體如-則在值和更為有效。作為通用修復液堿性值的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性值的修復液則優(yōu)于堿性的修復液，所以兩種抗原修復液可作為相互替補

24、的進行抗原修復。在進行過程中應防止切片的干燥，加熱時必須達到規(guī)定的溫度，保溫時間要足夠，對于一些不要抗原修復的抗體最好不要采用處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復聯(lián)合應用。方法有：水浴加熱法將脫蠟人水后的切片放人盛有修復的容器中，放人加熱煮沸水中，當修復液溫度達到5左右時計時，自然冷卻，洗X次。微波加熱法將切片放入修復液中微波加熱使溫度在6左右，計時，在微波爐中停留，室溫自然冷卻，洗X次。3于高壓加熱法:將修復液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中（要使修復液淹沒切片于開始噴氣時蓋上壓力閥。計時,冷水沖至室溫取出切片，洗X次。（5顯色免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問題，一般

25、辣根過氧化物酶的檢測系統(tǒng)選用或顯色系統(tǒng)進行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴格控制，以檢出物達到最強顯色而背景無色為最終點，尤其顯色時間短著色淺，時間長背景又深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗在配制完后最長宜放置以內(nèi)，過時不能使用，加到組織切片時作用時間最長不宜超過最好在內(nèi)，否則不管有無陽性都應終止反應。對一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用顯色時極易出現(xiàn)背景色更應盡早在鏡下控制，以達到最佳的分辨效果（棕色）。顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶最好選用作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍黑色）。（）結(jié)果判斷免疫組化的結(jié)果判斷有兩種方

26、法：一是對以檢測結(jié)果陽性細胞指數(shù)來定性在如核抗原的標記，判斷方法是以一個視野中的陽性細胞數(shù)與總細胞的百分比，再取10個相同視野算取平均指數(shù)。另一種方法以染色陽性強度和陽性檢出率相結(jié)合而定，一般陽性細胞數(shù)在02為5陰性，25為5十0，50為7十5十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實驗室最好能用圖像分析系統(tǒng)進行結(jié)果檢測定量分析更為準確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標準，但各單位采取的標準不盡相同，所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學術(shù)界商討判定標準。中常見的抗原表達模式有以下幾種：1細胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應如此，如細胞角蛋白，和波

27、形蛋白等；2細胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如多克隆抗體的染色；3胞漿內(nèi)局限性點狀陽性，如抗體的染色；4細胞膜線性陽性，大多數(shù)淋巴細胞標記的染色如此，如、；）細胞核陽性，如及雌、孕激素受體蛋白、等。一種抗體可同時出現(xiàn)細胞漿和細胞膜的陽性表達，如可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽性反應；抗體可同時呈膜性和胞漿內(nèi)點狀陽性反應等。（）對照片的設(shè)置免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。對照包括陰性對照、陽性對照和自身對照。在實踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對照，而用含抗原的正常組織作陽性對照，這種自我對照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果

28、時，先觀察對照組織的結(jié)果，如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽性，陰性對照細胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術(shù)操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結(jié)果。免疫組化染色中對照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測每一個抗體的質(zhì)量標準，常設(shè)的對照如下，一般實驗最常用的只選第二種方法。）空白對照陰性對照第一抗體由或非免疫血清取代。）陽性對照用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。）回收實驗陰性對照已知抗原與相應的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結(jié)果為陰性。）替代對照用于第一抗體同種動物的血清

29、或無關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。）自身對照在同一切片上，應將不同組織成分中的陽性或陰性結(jié)果與檢測的目的物對照比較。如、在正常組織中的血管壁肌層應為陽性，可以間質(zhì)細胞，對照以血管壁及肌束為對照，蛋白以小神經(jīng)末梢為對照等，如果應為陽性的組織是陽性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。免疫組化染色一石蠟切片免疫組化染色實驗步驟：石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應置0小時）。（）二甲苯I、各分鐘。（）梯度酒精：，分鐘T,分鐘T,分鐘T,分鐘。（）蒸餾水洗：分鐘，次（置于搖床）。2過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：，室溫分鐘（避光）。3蒸餾水洗：5分鐘,2次（置于搖床）。4抗原修復：根據(jù)待檢測的抗原,選擇適當?shù)姆椒?。附：抗原修復液（枸椽酸鈉緩沖液）的配制（）儲備液的配制：液：枸椽酸三鈉蒸餾水液：枸椽酸蒸餾水（）工作液的配制：液蒸餾水抗原修復的方法：（）高壓鍋處理技術(shù)：枸椽酸鈉緩沖液（，）淹沒切片蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸上汽分鐘后緩慢冷卻（可用自來