柱前衍生高效液相色譜法同步檢測生鮮肉中過氧乙酸和過氧化

1、柱前衍生高效液相色譜法同步檢測生鮮肉中過氧乙酸和過氧化氫殘留收稿日期：作者簡介：陳東宇（1986），女，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。*通訊作者：湯曉艷，（1976-），女，副研究員，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，郵箱： HYPERLINK mailto: ；孫京新，（1971），男，教授，研究方向：肉品質(zhì)量控制，郵箱： HYPERLINK mailto:jxsun20000 jxsun20000?；痦椖浚簢摇笆晃濉笨萍贾斡媱濏椖空n題（2009BADB7B07）陳東宇 1,2 湯曉艷1* 孫京新2* 王敏1 金芬1 毛雪飛1 1(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)

2、量安全重點實驗室，北京 100081）2(青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島 266109）摘要：本研究利用柱前衍生方法建立了一種同步檢測生鮮肉中過氧乙酸和過氧化氫殘留的高效液相（HPLC）色譜法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，加三苯基膦（TPP）及1-甲基-4-甲硫基苯（MTS）衍生，除脂，過SPE C18小柱，過0.22m濾膜后上機檢測。高效液相色譜法采用粒徑為5m固相填充料的Agilent C8色譜柱，乙腈水溶液梯度洗脫，流速為0.6mL/min，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。根據(jù)最低添加濃度和3倍信噪比設定得出過氧化氫（H2O2 ）最低檢出限為0.01mg/L，過氧乙酸（PAA）最低檢出限為0.015

3、mg/L。該方法首次實現(xiàn)生鮮肉中過氧乙酸和過氧化氫殘留的同步檢測，方法準確、靈敏度高、重復性好，可以滿足生鮮肉中過氧乙酸和過氧化氫殘留監(jiān)測的需求。關(guān)鍵詞：高效液相色譜；柱前衍生；過氧乙酸；過氧化氫；生鮮肉1 引言過氧化氫和過氧乙酸均系廣譜、速效、高效滅菌劑，二者均有強氧化劑性，可將菌體蛋白質(zhì)氧化而使微生物死亡，因此在食品企業(yè)中，過氧化氫及過氧乙酸主要作為加工助劑被用于食品冷凍庫及食品用工具、設備及地面的消毒1。但是現(xiàn)在有些不法商販將過氧化氫或過氧乙酸直接用于處理食品，如近年來出現(xiàn)的“北京美容豬蹄事件”，就是將劣質(zhì)豬肉用過氧化氫漂白，加火堿使之膨大，再用亞硝酸鈉發(fā)色，冒充優(yōu)質(zhì)豬蹄銷入市場2。過氧

4、化氫和過氧乙酸對人體健康傷害很大，具有急性毒性、致癌、致突變特性，對呼吸道有強烈刺激性，口服會出現(xiàn)腹痛、胸口痛、呼吸困難、嘔吐、體溫升高、一時性運動和感覺障礙等癥狀3,4。為此，衛(wèi)生部在2011年修訂的GB2760食品添加劑使用標準中廢止了將過氧乙酸和過氧化氫作為食品加工助劑的使用要求5，同時國家質(zhì)檢總局也發(fā)布公告，不再受理包括過氧乙酸和過氧化氫在內(nèi)的33種產(chǎn)品的食品生產(chǎn)許可申請6。目前，對于過氧乙酸和過氧化氫的測定方法主要有滴定法7、分光光度法8、熒光法9，10、化學發(fā)光法11、電化學法12,13,14及色譜法15,16,17。但這些方法大多針對于消毒水中高濃度成分的檢測，如滴定法、分光光度

5、法，靈敏度低、干擾因素多、不適用于食品中微量殘留的測定；而熒光法、化學發(fā)光法、電化學法操作繁瑣、反應條件不易控制、普及性差；色譜法靈敏度高、連續(xù)操作性好、使用范圍廣，可以精確定量微量殘留，但尚未見有在食品中同步檢測兩種物質(zhì)的方法報道。本文采用柱前衍生高效液相色譜法同步檢測生鮮肉中過氧乙酸和過氧化氫殘留，為食品尤其是生鮮肉質(zhì)量安全檢測監(jiān)管提供技術(shù)支撐。2 實驗部分2.1 儀器、試劑與材料Waters 2695高效液相色譜儀，配2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）； Agilent C8 色譜柱（150mm2.1mm i.d.,5m，美國Agilent公司）；SPE C18固相萃取小柱

6、（美國Agilent公司）；微孔濾膜（0.22m，美國Fisher 公司）；臺式高速冷凍離心機（德國賀力氏公司）；高速組織分散機（德國IKA公司）；冷凍研磨機（德國IKA公司）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WRTEX-5渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；雷磁 PHSJ-3F pH計（上海精科儀器有限公司）；MilliQ 超純水器（法國MILLIQ公司）；電子天平（XS105DU,瑞士梅特勒公司）。三苯基膦標準品（TPP）、三苯基氧化膦標準品（TPPO）、1-甲基-4-甲硫基苯標準溶液（MTS）、甲基苯基亞砜標準品（MTSO）（美國SIGMA-ALDRIC

7、H公司）；過氧化氫標準溶液（1000mg/L，天津市光復精細化工研究所）、過氧乙酸（16%18%）（分析純，使用前標定）；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC 級，美國Fisher 公司）；其他藥品均為分析純；實驗用水為Milli-Q超純水。生鮮雞肉購置超市。2.2 標準溶液配制及標定 MTS、MTSO、TPP、TPPO標準貯備液的配制：用乙腈分別溶解MTS、MTSO、TPP、TPPO標準品，配制成10mg/L的MTSO、TPPO標準貯備液和100mg/L MTS、TPP的溶液。制作標準曲線時，將MTS、MTSO、TPP、TPPO標準貯備液配制成不同濃度的標準工作液。過氧化氫及過氧乙酸標準溶液須要現(xiàn)用

8、現(xiàn)配，并在使用前標定其濃度18,19。2.3 樣品前處理提?。簩⑸r雞肉用冷凍研磨機絞碎，準確稱取3.00g破碎肉樣，加7g無水硫酸鈉勻漿1min，10mL乙腈超聲提取10min， 4條件下10000r/min離心10min，取上清液；將沉淀再次重復上述步驟提取，取上清液，合并兩次上清液，加磷酸鹽緩沖溶液并調(diào)pH至55.5之間。衍生：柱前衍生參照Ulrich Pinkernell16的方法，取5mL提取的上清樣液，加入過量MTS溶液，與樣液中過氧乙酸避光反應30min生成MTSO；再加入過量TPP溶液，與樣液中過氧化氫避光反應20min生成TPPO。凈化：用正己烷除脂，然后過經(jīng)活化的SPE C

9、18小柱，棄去前1mL，收集過濾液，再過0.22m的濾膜，制成樣品溶液上機待測。2.4 色譜條件色譜柱：Agilent C8 色譜柱（150mm2.1mm i.d.,5m）；流動相：A為乙腈、D為水；流速：0.6mL/min；梯度設置：03min，40% A；3.110min，60% A；10.112min，40% A；柱溫：25；檢測波長：225nm；進樣量：20L。3 結(jié)果與分析3.1 色譜條件的確定本方法采用乙腈-水為流動相，采用梯度洗脫方式，具體參數(shù)見2.4。由于流動相乙腈比例較大時，TPPO和MTSO的保留時間較短，難以和溶劑峰分開，故初始流動相乙腈：水最佳比例設定為40：60，MT

10、SO、TPPO目標峰在前3min內(nèi)洗脫出來；同時衍生劑MTS、TPP出峰較慢，為了加快洗脫時間，在3min后加大了乙腈比例，乙腈：水最佳比例為60：40。流動相流速選擇發(fā)現(xiàn)流速為1mL/min、0.8 mL/min時TPPO、MTSO出峰較快，不易于與溶劑峰分離；流速為0.6 mL/min時，目標峰與溶劑峰分離效果較好。圖1為是確定的乙腈-水梯度洗脫，流速為0.6 mL/min時 MTSO、TPPO、MTS、TPP的高效液相色譜圖， MTSO、TPPO、MTS、TPP的保留時間分別為1.098min、 2.948min、5.544min、10.219min。1.MTSO2.TPPO3.MTS4

11、.TPP圖1 最佳色譜條件下MTSO、MTS、TPPO、TPP的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromagram of MTSO、MTS、TPPO、TPP in optimum condition3.2 提取條件的確定本研究分別采用磷酸鹽緩沖液、乙腈：水（40:60）、純乙腈提取生鮮肉中的H2O2、PAA ，結(jié)果顯示，用磷酸鹽緩沖液提取時， MTSO和TPPO的加標回收率達170%、203%，基質(zhì)效應明顯；同樣，乙腈：水（40:60）作為提取液時，MTSO和TPPO的加標回收率達130%、147%，基質(zhì)效應也很明顯；而以純乙腈提取時，MTSO和TPPO的加標回收率分別為79%、85%，

12、基質(zhì)效應不明顯。因此，本方法提取液選擇純乙腈進行低溫超聲提取生鮮肉中的H2O2和PAA。由于pH值5.0-5.5的環(huán)境可抑制過氧乙酸和過氧化氫的分解，還可以避免TPP被氧化，因此，本方法采用磷酸鹽緩沖液作為提取環(huán)境pH值調(diào)節(jié)的緩沖體系，并將pH調(diào)節(jié)至5.0-5.5。3.3 衍生條件的確定本研究對衍生順序、衍生反應時間、目標物與衍生劑反應配比及光照條件進行了考察。不同衍生順序時MTSO、TPPO的生成量見圖2。結(jié)果顯示，先加TPP或同步加入TPP和MTS與H2O2及PAA反應時，雖然H2O2的衍生產(chǎn)物TPPO的生成量沒有明顯的增加，但是PAA的衍生產(chǎn)物MTSO的生成量卻明顯降低，而先加MTS反應

13、一段時間后，再加入TPP，兩種衍生產(chǎn)物MTSO、TPPO的生成量都達到最大。不同衍生時間下PAA和H2O2的衍生情況見圖3。結(jié)果顯示，PAA和MTS反應30min左右MSTO生成量最大，H2O2和TPP反應20min左右TPPO的生成量最大。因此，PAA和MTS反應的最佳衍生時間為30min，H2O2和TPP反應的最佳衍生時間為20min。圖2. 不同衍生順序條件下MTSO、TPPO的生成量Fig 2 Different derivative order on the production of MTSO、TPPO圖3 不同衍生時間下MTSO和TPPO的生成量Fig.3 Different d

14、erivative order on the production of MTSO、TPPO 圖4 不同反應配比下TPPO的生成量 Fig.4 Different ratio of H2O2 and TPP on the production of TPPO 圖5 不同反應配比下MTSO的生成量Fig.5 Different ratio of PAA and MTS on the production of MTSOH2O2和TPP及PAA和MTS反應的最佳濃度配比見圖4、圖5。由圖可知，H2O2和TPP的反應配比為1:2時，TPPO的生產(chǎn)量達到最大；PAA和MTS反應配比為1:4時，MTSO

15、的生產(chǎn)量不再顯著增加。因此，H2O2：TPP和PAA：MTS的最佳反應配比分別為1:2和1:4。3.4 方法的線性范圍、檢出限、回收率及精密度在優(yōu)化的實驗條件下，以初始流動相分別配制0.15-5.00mg/L MTSO、0.10-5.00mg/L TPPO系列混合標準工作液。以各相應組分峰面積(y) 對濃度(x，mg/ L) 繪制標準曲線。結(jié)果表明，MTSO、TPPO在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別達到0.9971、0.9985。根據(jù)添加的最低濃度和3倍信噪比設定得出MTSO和TPPO的檢出限分別為0.015 mg/ L和0.01 mg/ L。（表1）在1mg/kg水平下進行

16、加標回收試驗，每個水平重復測定6次，MTSO的平均回收率為78.9%，RSD為2.7%；TPPO的平均回收率為82.6%，RSD為4.1%，說明方法的精密度較好。(表1)表1 MTSO、TPPO線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率及精密度Table 1 Linear equations , correlation coefficient s , LOD , recoveries and RSD名稱線性范圍Linear ranges(mg/L)線性方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoeficiants檢出限LOD(mg/L)添加濃度Added(mg/kg)回收

17、率Recovery(%)（n=6）相對標準偏差RSD(% )MTSO0.155.00y = 2E+06x + 586800.99710.015178.92.7TPPO0.105.00y = 9E+07x 6459230.99850.01182.64.14. 方法應用模擬市場上可能會出現(xiàn)的違法使用過氧化氫及過氧乙酸浸泡生肉的現(xiàn)象20，用0.5%的過氧化氫及過氧乙酸混合消毒液在4浸泡生鮮雞肉30min。利用本研究方法測定雞肉中H2O2和PAA殘留量分別為0.3mg/L、1.08mg/L，色譜圖見圖6。MTSTPPMTSOTPPO圖6 0.5%混合消毒液浸泡后生鮮雞肉中H2O2、PAA殘留檢測色譜圖

18、Fig.6 Chromatatogram of the residual for H2O2、PAA in fresh chicken treated with 0.5% disinfectant 本研究建立的生鮮肉中H2O2和PAA柱前衍生高效液相色譜是首次實現(xiàn)在生鮮肉中同步檢測過氧化氫和過氧乙酸的殘留，方法準確、精密度高、實用性強，能夠很好地滿足生鮮肉違法添加使用過氧化氫和過氧乙酸消毒液的監(jiān)測需求，為食品尤其生鮮肉質(zhì)量安全監(jiān)管提供方法支撐。References1.Kitis, M., a review. 2004，Environ.Int. 30, 4755.2. HYPERLINK /a/2

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27、ey Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture,P.R.China ,Beijing 100081, China . 2(Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China）Abstract: A method was established for simultaneous determination of peracetic acid (PAA) and hydrogen peroxide(H2O2) in raw meat using pre-column derivatization high performance liquid chromatography(HPLC). Samples were ultrasonic extracted with acetonitrile and added meth