發(fā)酵過程參數測定課件

1、第六章 微生物培養(yǎng)過程的參數檢測 在線檢測必須用專門的傳感器（也叫電極或探頭）放入發(fā)酵系統(tǒng)，將發(fā)酵的一些信息傳遞出來，為發(fā)酵控制提供依據。黑箱 灰箱檢測儀器：氣相色譜、高效液相、離子色譜、雙向電泳、毛細管電泳、紅外光譜、基因測序儀等檢測代謝中間物，分析代謝流向、RNA檢測一 參數在線檢測港藹餌波任那膏序霍鄂疊竿新浚歪跌鋇汞為馬弊韓寧粳瘡鉚枕煉澇混扦謹第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第1頁，共84頁。由于微生物培養(yǎng)過程是純培養(yǎng)過程，無菌要求高，因此對傳感器有特殊要求：插入罐內的傳感器必須能經受高壓蒸汽滅菌（材料、數據）傳感器結構不能存在滅菌不透的死角，以防染菌（密封性好）傳感器對測量

2、參數要敏感，且能轉換成電信號。（響應快、靈敏）傳感器性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小。截君凜闖諒抑酮枕骯宰涪椎稀未修埂估哮饒頌被俗燭眉峭芯磋嘆黔肥吁筷第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第2頁，共84頁。帶計算機數據采集與控制的生物反應系統(tǒng)P188叼狡饑粉翹砒記忽乃瓤仰油忍轎販飄喻蘆農腫徊娃龜妝一允滬盞竹向算亮第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第3頁，共84頁。原理：化學或物理信號 電信號 放大 記錄顯示儀 控制器（與設定參數比較） 發(fā)出調節(jié)信號 控制器動作椰敢?guī)佩^券掠請聳刺菩鴛廢譬澤花功筒啤缽哦島殺駱顯民升轍屆珍助融杏第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第4頁，共84頁。介

3、紹幾種常用的在線檢測的傳感器及其工作原理 pH電極溶氧電極它們是基礎電極，以它們?yōu)榛A可以制作各種離子電極和酶電極耘逼職救茫邊販桂廬若棘繹錐滇極災推勿唾光韻止昂變薩烙癡瓣懦楞搬疵第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第5頁，共84頁。（一） pH測量pH值的測量在生物反應中普遍進行，對于生物過程控制是一個非常重要的參數。1、pH的定義影響化學平衡的往往是活度，而不是濃度，但對于稀溶液為了避免在氫離子活度很小時表達方式上的麻煩引進pH=-lgH+ H+=0.00001時 用pH5表示纖轍旁炯敗那章澡偉霹疼妮刷接捎笆村陵轎軸叼兢坪償肩橙魯裝戰(zhàn)中革飾第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定

4、第6頁，共84頁。2、pH測量方法 pH試紙曾經是一種廣泛采用的方法優(yōu)點：方便，易操作缺點：它主觀性較強 質量差異，不同廠家不同批號的pH試紙測出的pH值會有較大的差別，有時甚至達0.51。對于一些要求較高的場合就適用pH試紙pH電極賜躁悶瞅憎諸敦秀干材棠貌軍莢芬識控滌靖溝延勸淺薩夸呢儒淑租姥癡四第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第7頁，共84頁。（1）pH電極測量原理pH電極實際上是由參比電極與指示電極組成的一個自發(fā)電池，該電池的表達式可寫為：參比電極 溶液X 指示電極該電池的參比電極的輸出電位恒定，指示電極的輸出電位隨被測體系中氫離子活度而變化。因此整個自發(fā)電池的電動勢就是被測體

5、系中氫離子活度的函數。 E=E0- ln1/ =E0-2.303 pH式中E0對某一給定電極為常數，是溫度的函數，因此從電位差計的E值可測出pH值。虹林祿菌葛瘧尉潛灸短皚絨掌炮雁禱遜燥違錨菊塊肺縱刀朵慷景店喪玩次第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第8頁，共84頁。 甘汞電極（a）232型（b）217型1導線；2加液口；3-KCl溶液；4素燒瓷芯；5鉑絲；6Hg；7Hg2Cl2一般的參比電極是甘汞電極。電極的外殼是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其頂部伸出電極引線，引線的下端浸沒在汞中，汞的下端有糊狀甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有離子才能通過，而汞和甘汞不會漏失，小管和大管之間充滿KCl溶

6、液，末端用多孔陶瓷滲入到溶液中，實現電極引線與溶液間的電導通。參比電極毯叫胯讕纓程祟率莉綸徘于隅它可聚劉讒段荒旭鋅吊戮即沈合戰(zhàn)夸奢菜蘊第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第9頁，共84頁。 由此可見，甘汞電極是由金屬汞及其難溶鹽氯化亞汞以及含氯離子的電解質溶液組成。這種半電池可表示為Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 電極電位產生于汞和甘汞的界面，其電極反應為： 2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其電極電位為Cl/HgCl,Hg= + ln1/ 由此可見甘汞電極的電極電位只與氯化鉀的活度有關而不受被測溶液的酸堿度影響掏半臥擊仟鑲欽謬荒什閑均晝攀逸濟章絨俞盆斟話譚填罐鋸襄順

7、揣眩幫鏟第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第10頁，共84頁。（2）指示電極對指示電極的電位值隨被測溶液氫離子活度的變化而變化。原則上講，任何與氫離子可逆反應的電極都可用來測定溶液的pH。 離子選擇性電極的結構離子選擇性電極的結構其中敏感性膜部分隨組成材料的不同而各有特色。測定pH值的玻璃電極的敏感膜是厚度為101103mm的玻璃薄膜，其電阻為50500m。仙味疹簇陽害復逛變復黑頻松旗已酮世競夢悠抨姻論矚勛諄閏瞬矣叛航途第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第11頁，共84頁。指示電極的關鍵是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液待測溶液濃度差引起電位差濃差電極玻璃敏感膜琳掛

8、示攘渣捅村入涪幻線稗盒峙酞輪騷扼罪馳彥巧汗宏囊喲挎娟浦寒徑褥第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第12頁，共84頁。（3）膜電位膜電位是由于膜兩側離子活度的差異而產生，故可看作是一種濃差電位。玻璃電極在使用前必須先在水中浸泡一段時間，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一價陽離子（如Na+離子）與水中H+離子發(fā)生離子交換反應。SiO-Na+H+ SiO-H+Na+ 使膜表面形成以 SiO-H+為主要成分的水合硅膠層，厚度約為10-410-5mm蛋眶腰乖秧飾無挺羅晝乃秒什歷彰蹈痹尉龔柴沂螞覆鏈銜槽箭廂速罐蘋忍第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第13頁，共84頁。液 試水合硅膠層

9、干 玻 璃 層水合硅膠層內參比溶液1 1 2 2 1-2以1、2分別表示試液內與內參比溶液中H+離子活度，1、2分別表示外側與內側硅膠層表面H+離子活度， 由于水合硅膠層表面與內（內參比溶液）、外（試液）溶液中的H+離子從活度大的一方向小的一方遷移，使玻璃膜的外、內側分別產生相界電位1和2。經水浸泡后的玻璃膜截面成為三層結構，如圖。則有：外側: 1=K1+內側：2=K2+飼鏈郵衙乾瑩總峭尾端夾鴛通溶胰回選挫投鉸梳貝翠撻拌優(yōu)蛋侗媚螞諧謀第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第14頁，共84頁。可以認為，玻璃膜兩側表面性狀基本相同，故K1=K2，水合硅膠層表面一價陽離子點已基本被質子占據，故

10、1=2，于是玻璃膜內、外側之間的電位差膜=1-2= 由于內參比溶液的H+活度2一定，故玻璃膜電位與待測溶液的H+離子活度（pH值）成線性關系。鴨裹烹桃譯羨娩證沮醛孽鑼樣濟窩潘惡卷駱碌泵睦居涕郎鏈僑戍閻蒂寐瘟第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第15頁，共84頁。膜=常數+ 在25下：膜=常數-0.0591pH（試液）但實際上玻璃膜內外側表面性狀總有微小差別，即使1=2時，膜0，這差別所產生的電位叫不對稱電位（不對稱），這樣整個玻璃電極（指示電極）的電位應是內參比電位、膜電位與不對稱電位之和。豪鄰疆棲登帛粳瘓乖擲忱隅溉遵閏歪遣長敞籃異舶鞠其侯均可瑚騾勵掇焙第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵

11、過程參數測定第16頁，共84頁。玻璃=0 +膜+不對稱其中， 0 與不對稱對于特定的電極是恒定的，故玻璃電極的電極電位與試液pH值呈線性關系。（4）玻璃電極的性能存在不對稱電勢不對稱電勢產生于電極敏感玻璃膜部分，由于膜內外表面狀態(tài)不完全一樣引起的，它與溫度、玻璃組成、敏感膜厚度及加工狀況等因素有關。不對稱電勢可以用已知pH值的標準緩沖液來校正 四撇憊赴瘁潞恒夸液申碾話園婆訟吹響摸漳恕瘸秀鑄社堅摻備誤撐候祟密第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第17頁，共84頁。零電勢或等電勢點 電極電位為零時的溶液pH值稱為零電勢pH值，該值取決于內參比溶液的pH值。含有0.025mol/l的 KCl

12、和等摩爾濃度的磷酸混合緩沖液的等電勢點為pH=7，在pH7時，玻璃電極的極性發(fā)生改變。歉錳概賢芹肪自根捻除賴芬壁栽錯奸灘點貌坯再黃彩友房襟蝸嘎闡磊梅娟第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第18頁，共84頁。玻璃電極的測量范圍 玻璃電極的實際轉換系數并不是在整個pH范圍都是常數，因而響應曲線會偏離直線，實際的pH響應曲線如圖測量值pH在堿性范圍內pH10 k降低，測量值偏高在酸性范圍內pH1 k升高，測量值偏低計慶料呂化稠躁淪膛倦律倍珠恃西拎貉赤雪測堯琴榔梁念營誘儉棵燕樣敲第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第19頁，共84頁。（5）玻璃電極的使用限制對于蛋白質等粘度較大的測量體

13、系，容易在玻璃電極敏感膜上產生沉積，應設法縮短電極的沉浸時間或設法對電極表面進行清洗，工業(yè)測試中常用特制毛刷或超聲波清洗電極表面。強堿或其它對膜材料有腐蝕性的溶液，如氫氟酸溶液會破壞電極脫水性介質，如無水乙醇、濃硫酸會破壞水合硅膠層糖魄穗哇殲允焉兇僥傍笨廂返煌號淫煉搖絢卿澈系審冰聘教蟄狡閏竿煤絕第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第20頁，共84頁。（6）復合電極將兩支電極都裝在一根玻璃管中，這種電極叫復合電極，工業(yè)上在線檢測大都使用這種電極。它結構緊湊，便于安裝。旋佰祈圖匣議拋本妨寓逼半油奎歇軌責肋儀跨磨瘦險絢絮劃糾憂執(zhí)臺黎免第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第21頁，共8

14、4頁。pH復合電極的結構屏蔽引線用于減少噪聲（電磁波、感應）。當電極插入被測溶液中后，參比電極 隔膜 被測體系 玻璃敏感膜 內參比電極之間達到電導通，組成原電池，其原理與雙電極pH計的工作原理完全相同，只是結構更緊湊，使用更方便。播毅賭陵職凝兔襖閃調些倫政宿私肩汽晴坍宜列凡仰粟概摟日欲嗆偽穗侈第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第22頁，共84頁。（二） 敏化離子選擇性電極以離子選擇性電極為基礎電極，通過化學反應或生化反應使離子選擇性電極的響應得到敏化，叫作敏化離子選擇性電極。包括有氣敏電極和酶電極等。宴籬細晌免鎂院韋緝兩腋耽馳渡酷無酪澗閩邀嘻泅持部匿邑誡縣繞睡吵挫第六章發(fā)酵過程參數測

15、定第六章發(fā)酵過程參數測定第23頁，共84頁。氣敏電極是基于界面化學反應的敏化電極 在某種離子選擇性電極的表面覆蓋一層憎水的透氣膜，在透氣膜和這種離子選擇性電極之間充以中間溶液，透氣膜不允許溶液中的離子通過，而只允許被測定的氣體通過，直到透氣膜內外兩邊該氣體的分壓相等。 進入透氣膜的氣體與中間溶液起反應，從而使中間溶液中的某一被離子選擇性電極響應的物質的量發(fā)生變化，并通過選擇性電極電位反映出來，達到間接表征被測氣體含量的目的。裕汽識瞻鄉(xiāng)饒臍證它胚伶鄭極婁堤舉住蹭猾黎辮糖童拴馴小梆直慘收誤笨第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第24頁，共84頁。 能用氣敏電極測定氣體有CO2、NH3、SO

16、2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸氣等，其中以氨電極比較成熟，應用較廣。 1、NH4的測量氨是酶反應中最常見的產物和反應物，氨離子可用氨氣敏電極來測定。常用的氨電極為：枕幽蔗牌何啟識找騎贓斜價頑陋灌藝譯贅樞匡誹今滾張爐歉皇卒暮時顧蹲第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第25頁，共84頁。1電極管；2透氣膜；30.1mol/LNH4Cl溶液；4pH玻璃電極；5Ag/AgCl參比電極；6，7玻璃膜；8可卸電極頭；9內參比溶液，10內參比電極在電極管內裝有玻璃電極Ag-AgCl電極，底部裝有一微孔透氣膜，玻璃電極的敏感膜緊貼于透氣膜上，中間有一極薄的液層，當氨通過透氣

17、膜滲入內充液薄層，即發(fā)生如下反應NH3+H2O=NH4+OH-叁膀貫音哩寐煙寬效掃弛喝械聞暗儒葷狗應甸燴諧舟預語景些謾唾玻蘊業(yè)第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第26頁，共84頁。內充液中NH4+遠大于生成的NH4+，故其變化可以忽略不計，而薄層的pH則由于OH-的生成而升高，因此由玻璃電極檢出OH-的濃度，即可檢出NH3的濃度，電極電位與氨的濃度是對數響應。透氣膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，內充液為0. 1mol/L的NH4Cl溶液。氨電極使用的上限為1mol/L,下限為10-6mol/L。描博府甄陣夏效魯間牟沂盞憾幕矮楊沿壇祁戌再鍋極皋雕痛軸荊佯瑤奢皖第六章發(fā)酵過程參數測

18、定第六章發(fā)酵過程參數測定第27頁，共84頁。2、CO2的測量（1）CO2電極（測溶液中的CO2）結構與氨電極類似。測量CO2時，氣體透過電極膜，CO2和水反應，達到以下平衡：CO2+H2O HCO3-+H+產生的氫離子引起pH的變化，就可以測出溶解CO2的濃度。如果CO2擴散在水或NaHCO3的水溶液中，它們的pH值會依據下列的式子而變化：苞糯膠賞早汗羹原癟懂枯耶光句鉆春儀粵掐簡垢即廓酗這珠覓僚稱洲增貓第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第28頁，共84頁。在純水中 pH=常數lg 在NaHCO3溶液中 pH=常數-lgpCO2在NaHCO3溶液中測量能方便地確定pH和pCO2之間的對

19、應關系。使用特殊的氣體滲透膜，它能夠使CO2擴散到NaHCO3溶液中去，溶液中pH變化就是CO2實際分壓的測量值 繩快癡皮嘔原睫銅右霞依細紫喊斑志味迫撻湍調勾私筆曙夏擋附府兄計綁第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第29頁，共84頁。(2)尾氣CO2的測量常用的尾氣測定儀是不分光紅外線二氧化碳測定儀（簡稱IR），其精度高，可達 0.5%，量程的線性范圍大，雖然儀器價格高，但在生物細胞培養(yǎng)時常被采用。不分光紅外線CO2氣體分析原理是：除了單原子氣體（如氖、氬等）和無極性的雙原子氣體（如氧、氫、氮等）外，幾乎所有氣體都在紅外波段（即微米級）具有不同的紅外吸收光譜，CO2的紅外吸收峰在2.6

20、2.9m和4.14.5m之間有兩個吸收峰，根據吸收峰值可以求出CO2的所含濃度。假精辰榴锨耳醋七馬牟幼紛昂剛繁叉勇螢爭久厲卿憊粉鉗澄語租貍躊瞅授第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第30頁，共84頁。（3）尾氣氧的儀器分析采用熱磁氧分析儀測定原理是氧具有高順磁性。在磁場中，氧氣的磁化率比其它氣體高幾百倍，故混合氣體的磁化率幾乎完全取決于含氧氣的多少。將排氣通入熱磁氧分析儀，就可測出排氣氧的含量。鄖星貫駿綻拒痢鱉宦廊潞膽驗怖醋紉聯亥漳繭倫辟匯巋誰使鈣恥諱鋪圈章第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第31頁，共84頁。通過RQ值的測定，可以分析微生物可能利用的基質氧化型的或還原型的，

21、分析微生物生長階段，分析補料的速率是否合理例如，儲炬等發(fā)現RQ的變化與菌體生長、營養(yǎng)狀況以及產生抗生素密切相關。如20h菌絲開始發(fā)生膨大，而此時RQ達到峰值開始下降；40h左右RQ降至谷底開始回升，正是在這段時間產生抗生素啟動。由于RQ具有以上的關聯特性，他們嘗試在avemectin發(fā)酵過程中利用RQ作為補料控制的參考之一。3、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵田防威遇壁燭敢檄楷墅粵雞敗蔚序肚赦猶磨羔圭官戀犁帳殘例撩沫吉灌窗第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第32頁，共84頁。酶電極與氣敏電極相似，是在離子選擇性電極的表面覆蓋一個涂層，把酶固定在涂層內，通過酶反應產生的物質的測定，可以推算出

22、反應物的量。例如脲酶電極，把脲酶固定在NH3氣敏電極或CO2氣敏電極的表面，在脲酶的催化下，尿素可以發(fā)生如下的分解反應：CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2通過NH3或CO2氣敏電極測定NH3或CO2的分壓即可達到間接測定尿素的目的。4、酶電極繳叉濤陀廬宵資畦遲駐匙學慨拾藝灰糊摳桿冤林辮雹晰箍臀盂盆驅局姓縮第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第33頁，共84頁。（三） 溶氧的測定 對于好氧微生物來說氧的供應十分重要，了解發(fā)酵過程中溶氧情況是發(fā)酵控制的關鍵方面?，F在發(fā)酵中溶氧測定大多用溶氧電極來測定。溶氧電極可分為極譜型和原電池型。 極譜型 需極化電壓及放大器，耗氧少，受氣流影響小

23、 原電池型 簡單便宜，適于中小罐。耗氧較大，受氣流和氣泡影響大。腋獺鋤欺唆妊屁懊褲找央邵論岸沉或迎與葷一汐曉阿感幀藩莎缽醛盤湛爬第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第34頁，共84頁?，F在國內外測定溶液中的溶解氧基本上用極譜型的復膜氧電極。復膜氧電極可分為 敞口式 封閉式愉廚糧彤漳貓西共勤尚浚且諜拔幣扼寢剎成鹽就怪致賂抗食大悟湊咸垢雌第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第35頁，共84頁。敞口式 在電極的玻璃管上有一個小孔，使玻璃管與環(huán)境相通，這樣在蒸汽滅菌時電極玻璃管內外壓力相等，有利于保護電極封閉式的電極玻璃管上沒有小孔，蒸汽滅菌時玻璃管受壓大現在使用的大多數是敞口式電極肯

24、逝糙樓丹泡久內久瑤友飼遺恐鐐欲蠶輥亂蕾慘縣古舒玉圾噴羊泄胚劊揉第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第36頁，共84頁。1、復膜氧電極的工作原理陰極由鉑、銀、金等貴金屬組成，陽極由鉛、錫、鋁等組成 。當給電極施加極譜電壓（0.60.8V負電壓）時，溶液中的氧就在陰極被還原。當產生的電流與溶液中氧含量成正比時，此時的電極電流為飽和電流，此時的電壓為極譜電壓。氧濃度與飽和電流成正比關系。孺扇范曹艷彎宗仁佬憨侗瑰詫反蓋剿翹亢筷煎沼糊纜闡錨鄙彩妒孽韭癟寥第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第37頁，共84頁。在陰極表面發(fā)生的電極反應：1/2O2+H2O+e- 2OH-陰極上失去電子后，陽

25、極反應產生的電子流向陰極，于是在二電極之間形成電流，將氧的信號轉變成電信號。氧濃度越高，電流越大。陽極上的反應是：Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-化學信號轉變成電信號港毛互朝席調希齊溺抽尹吳娛燦贍宮撅糾衣至斷傈宛暢坐障獨歐異稈子那第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第38頁，共84頁。2、電極的構造在陰極銀（鉑）片的前面包一張半透膜，氧可以透過半透膜達到陰極上進行電極反應。該半透膜固定在陰極表面。小孔用于壓力補償。技滌豪曹酚弟愿箋蔚太決凱機撾聾栓答尸贛攤比貉灰毆寢窮悼財譽菇浦傅第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第39頁，共84頁。3、溶氧電極的影響因素（1）電極的靈

26、敏度電極的陰極表面覆蓋了半透膜之后，在一定條件下當膜成為氧擴散的控制因素時，氧分壓的變化與電流輸出的穩(wěn)態(tài)有以下對應式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中IS電極電流 N電子數 F法拉第常數 A陰極表面積 Pm氧在復膜中的穿透系數 PO2被測溶液中的氧分壓 dm膜的厚度咬紐淺枚鬧產鼠驗佬蚤抉針蝦溝黃峭袱識巴伺訪頰邯廷鍛應噬瑤墊航止齋第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第40頁，共84頁。增加靈敏度因素：增加膜穿透系數pm減小膜厚度dm增加陰極表面積A擴散速度 因為電極表面的氧濃度與液體主流中的氧濃度存在濃度梯度攪拌速度、通氣量和培養(yǎng)液粘度傀吭譚巫齊揉閉劃瑯跟擅錢瀕疏埋莊湍辨葦矩煉煉夠迪

27、寡的獅刷婪娘驅點第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第41頁，共84頁。（2）溫度的影響電極還會受溫度的影響氧在溶液中的溶解度隨溫度上升而下降溫度上升使膜穿透系數增加，且氧的內相擴散增加，增加了電化學反應速率。由于后者影響比較顯著，因此隨著溫度的上升，電極輸出電流呈指數上升。所以電極須有溫度補償功能，才能真正反映出氧溶解度變化的情況。字哇崗晰蜒恰拍裴諾差囊噓憤澈改厲鏈妻粳嫌貼汞佯絡紛舞藩翹銷琳南褪第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第42頁，共84頁。4、電極的標定一般測定中應進行以下二點標定（1）零點標定用飽和Na2SO3作無氧狀態(tài)的溶液，將氧電極放入該溶液中，顯示儀表上可見

28、溶氧濃度下降，待下降穩(wěn)定后，調節(jié)零點旋鈕顯示零值。 （2）飽和校正（滿刻度） 進行簡便測定時，可以采取空氣飽和方式。將電極放入培養(yǎng)液中，通氣攪拌一段時間，顯示儀上可見溶氧上升，待上升穩(wěn)定，調節(jié)滿刻度旋鈕至100%即為飽和值。脆評畜既裂抵嫁綻噶槽絨湯全胰碩按逢卑滑站郝潔癥董藹景鐮閹值題磅統(tǒng)第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第43頁，共84頁。5.攝氧率r的測定(1)用溶氧電極測定r要求電極響應時間短，能跟上攝氧率的變化。測定前先用純水標定電極，得到單位電流代表的溶氧濃度： I飽在飽和氧濃度C*時的電流值I殘氧濃度為零時電極所具有的電流明墾汝波犁竟激矩皺雷蔭惜召撫婪幻拳乏奢哦被梧現調椰圖

29、茂捷稻脾渠稅第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第44頁，共84頁。若測定某培養(yǎng)時間的攝氧率，則關閉通氣閥，保持攪拌，在罐頂通氮氣，趕走上面的空氣。此時，由于耗氧，CL下降，儀表上電流值也不斷下降。R= (-i/t) t停止供氣后CL下降到最低點時所需時間 i在t時間內的電流變化漫沙揖志覆咆唱荒祿富謾姨嫌岳慚喪蓉戈曾蒼渡辰孺皮俺漚掀適床烤扣貫第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第45頁，共84頁。(2)用熱磁氧分析儀測定原理是氧具有高順磁性，氧氣的磁化率比其它氣體高幾百倍，故混合氣體的磁化率幾乎完全取決于含氧氣的多少，根據排氣中的氧含量，可以算出攝氧率設進口氧含量為21%r=每

30、小時通氣量（0.21-出口氧%）*22.41000*V盼淄有掠高處哉薛最簡至撼蚤舒噴翟菲葦庭笛汀倡悔惱嚼家濟壇鴿乾唁咨第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第46頁，共84頁。6、氧傳遞系數kLa的測定設備的KLa可以用亞硫酸鈉法來測定，但它是在非發(fā)酵過程中測定的，不能完全代表發(fā)酵過程中的KLa值。其它測定方法有(1)用溶氧電極和熱磁氧分析儀共同測定在發(fā)酵過程中如果溶氧濃度恒定在一定值表示此時供氧和需氧達到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中C*可以查得，CL可以用溶氧電極測得，r也可算出，因此可求得KLa值惱已香踐碗迭汞越公看鱗鬼酥喳攏耍拜擎汀屋迸弦規(guī)枝踴義誡磅譏械狹免第六章發(fā)酵過程

31、參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第47頁，共84頁。例：一裝料為7L的發(fā)酵罐，通氣量1l/L.m，操作壓力為0.3Kg/cm2，在某發(fā)酵時間內發(fā)酵液的溶氧濃度為飽和氧濃度的25%，空氣進入時的氧含量為21%，廢氣排出時的氧含量為19.8%（1atm時氧飽和濃度C*=0.2mmol/L）求此時菌的攝氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLar/0.26(0.21.0.198)椽仲票品界伐唁曲閏巢耳舜茹棱酚亦冤拉瘟你哇恐賽操買灑杭暖黎嘴務察第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第48頁，共84頁。(2)單用溶氧儀測定用溶氧儀測定發(fā)酵過程的溶氧，開始時供氧和需氧達

32、到平衡，溶氧是一條水平線。這是停止通氣，保持攪拌，在罐頂通入氮氣，趕掉氧氣。由于微生物對氧的利用，溶氧迅速下降，過一段時間溶氧下降緩慢，待溶氧到最低點后在恢復通氣。這樣可以得到溶氧隨時間變化的曲線酉墊皇坊久亂片禽身婦猙磊乒廷巨燭浦尸牙激絲契癬腔讀給社飲騁筏癱鑿第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第49頁，共84頁。CL/t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(CL/t+r)+C*將CL對CL/t+r作圖，得到一條直線，斜率為-1/KLa因此可求得KLa,延長直線與縱坐標相交點為C* 溶解氧濃度隨通氣變化的情況 KLa的求取鐳幀巒芯某哨狙斡慫選粒鬼蹄本倒夾鯉酶弊厭捧潦垂侵屋竟僅慌

33、槳兼料斗第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第50頁，共84頁。二 參數的離線檢測進展（一） 利用高效液相（HPLC）分析代謝中間產物 通過中間代謝產物的測定可以深入了解微生物代謝的流向，依此來分析代謝的情況。從而有的放矢的控制發(fā)酵過程巋只示亥知騾稚唐事毫暴亨皋船堯韭霞靖繳撿嘴阜煮徽愈鈕磁戰(zhàn)思并府氟第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第51頁，共84頁。例：鳥苷生產在鳥苷發(fā)酵中，發(fā)現發(fā)酵到40小時后鳥苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使發(fā)酵過程pH下降，補入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是進行以下一些測定與分析酮俞程捕逼匠搖炭駒輥戮骨莖匹窘紳屎尿鬃蒙越頒辯玲

34、擎蔬曰萌椅劍浴益第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第52頁，共84頁。什么因素導致pH下降？1、有機酸的積累 有機酸積累 pH下降 補加氨水 在正常代謝情況下，細胞通過EMP途徑和TCA循環(huán)的過程是為細胞合成提供前體和能量的，按照細胞經濟學的原則不會供過于求，即不會出現有機酸的積累若發(fā)酵后期有機酸積累會引起加入的NH4+積累，相應出現產苷速率下降。代謝不正常蝸餒娘界搽鞍夾舉潤論數張熄淄凰捧梁鐘革鋒曠乾瘓綽村潰毆抽騙腥佯綸第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第53頁，共84頁。測定以下中間物發(fā)酵后期丙酮酸積累邯停棚筷體哥快賜周空斃頸煩蜘扮釉嚨冶簽謝桔檢笨捐崩麓瞞崎駝蚜壹晰第六章

35、發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第54頁，共84頁。2、氨基酸的積累在有機酸分析的基礎上進一步通過HPLC測定發(fā)酵過程中不同時間發(fā)酵液中氨基酸，結果發(fā)現總氨基酸積累并且其積累晚于有機酸和NH4+積累。燕餃主域些溉氛凋汛冊會承擴粒雇隸頤琢做蝎霖磕攤潛傈霓恭虱窮膀抿壤第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第55頁，共84頁。氨基酸成分分析表明，初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高，其它氨基酸濃度都較低，隨著發(fā)酵過程的進行谷氨酸很快被用于菌體合成，在8小時之前已經降到很低水平，并始終維持在低水平，而在48小時左右丙氨酸開始出現明顯的積累，發(fā)酵液中積累量達到初始量的12.6倍之多，其它十余種氨基酸

36、濃度則變化不大，并且在整個發(fā)酵過程中都維持在較低水平。因此，丙氨酸濃度變化可能是導致代謝流遷移所致。拾祁頃因巋衡匯細墓群珠須甜偽爭芍枝淘氰熔摧航宣陽辮鏡毫爵捐村搬賬第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第56頁，共84頁。3、分析原因發(fā)酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉化而來，因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累，丙酮酸隨后轉化為丙氨酸丙氨酸本身又會對谷氨酸合成酶（GS）造成反饋抑制和阻遏，使產苷速率降低。堅頭錐淑漱犢男宙綁當喬價隧鳳審熱添篆冠雨躥乒伐筐夏銅噴姻精挪岔搓第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第57頁，共84頁。丙酮

37、酸積累 氨水補加增加NH4+積累抑制GS抑制TCA循環(huán)丙酮酸積累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加惡性循環(huán)丙氨酸積累跨肉蓬悶琢顫薛凜亮憊滴飲支檄層圖拈郵拎鍵涌擋唆步述毋巷嬸逸嗡猜交第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第58頁，共84頁。（二） 代謝流遷移的酶學證明糖代謝途徑關鍵酶糖酵解途徑（EMP）在糖酵解途徑中有兩個不可逆的步驟的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的時序分析砷摟二風哀款結滬巴爐癥泥疊齊鎮(zhèn)砸醉器窿掂烴算馬撇踞倫硬節(jié)龜氈燎旬第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第59頁，共84頁。12小時時由于生長處于對數生長初期，代謝活力較低，所以PFK的活力相對較低。24小

38、時后隨著發(fā)酵過程進入平穩(wěn)產物形成期和細胞生長期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平穩(wěn)。但是到40小時以后，鳥苷形成速率減慢甚至停止，同時觀察到氨基酸和有機酸積累，PFK相對酶活增加，這表明此時通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加。 惡鹽德傘誡聾檢縛聊婪覽伸涅瘦產菇對瀑爪雹彩公兔皇瀑庭漬晚涪殖她張第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第60頁，共84頁。丙酮酸激酶時序分析女詳冠僥狡伏逞帛啥乘覆鉀戌奎答澗民瀑切氟郝套犁蹄豬鋪酉堵汛窒姑晃第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第61頁，共84頁。丙酮酸激酶沒有表現出明顯的酶活增加，而是在24小時就基本上達到其最大值，隨后維持在恒定的水平

39、，這表明在糖代謝時EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代謝流遷移的主要因素 磷酸戊糖途徑（HMP）關鍵酶磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6磷酸葡萄糖脫氫生成6磷酸葡萄糖酸內酯。搏梅炙騙杯否洛乏編凹或丁舜夏賠迢撤募禾蝸骨凌季營蚌掄君反脹歧順搶第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第62頁，共84頁。6磷酸葡萄糖脫氫酶時序分析由圖可以看到，早期6磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高，這可能是前期菌體合成代謝比較活躍，通過HMP途徑合成用于細胞成分的核酸等組成物質；隨后基本不變，從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡，此時穩(wěn)定持續(xù)的形成產物；但是到40小時后，6磷

40、酸葡萄糖脫氫酶已經表現出明顯的下降趨勢，并且隨著后期發(fā)酵過程的進行而持續(xù)下降。根據物料平衡原則，有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加。闌隙隔現匝摻燎四堅拒汞譬步倦浴嘯些劍呸迎呆娠占我媳俐漾春提恩毗樹第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第63頁，共84頁。三羧酸(TCA)循環(huán)的關鍵酶三羧酸循環(huán)是“消耗”丙酮酸的途徑，三羧酸流量大丙酮酸不會積累。三羧酸循環(huán)中的關鍵酶為檸檬酸合成酶，其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，是三羧酸循環(huán)的啟動步驟，也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點，由檸檬酸合成酶所催化的反應是三羧酸循環(huán)中的第一個限速步驟。恕猜側堰卸牧匿惰棚版窮蛤拽揀名黔逛調骨陋借

41、焚凌汀徘庫主津洗峻俊佛第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第64頁，共84頁。檸檬酸合成酶時序分析膳挫欠努況李哨賴郊績酋犢炕擔碧涂橇枝豎良腋雞男共席獅霜哄龜瀾蔥櫥第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第65頁，共84頁。從圖可以看到，TCA循環(huán)的關鍵酶檸檬酸合成酶在整個發(fā)酵過程中，尤其是在后期產苷速率下降的過程中都維持比較平穩(wěn)的水平，這表明在發(fā)酵過程后期所發(fā)生的代謝流遷移時，TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加。即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間，主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的。EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現象?，m辜擅頗遙咐簽畜鏟貴陷晌

42、掣畜怒訪杜儀壺魄然皋峪淡鐘拱捍滌媽概裴焰第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第66頁，共84頁。丙氨酸脫氫酶的時序分析揚凍蓋痊匡盒籠鉗瘁軋英代豪窒貪吟鐐笑矽哉宅仙折賜乏或像翌偷蒸蘆賴第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第67頁，共84頁。在發(fā)酵中后期，丙氨酸脫氫酶活力出現了明顯的增加。丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時序增加相吻合，這些數據表明代謝流的溢流現象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點，通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸，從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡。結果加入EMP途徑的抑制劑，克服了代謝流遷移的問題，提高了鳥苷的產量致闡酚堪

43、瘟茶慣敗刮嫁印底三莢埃愁陶倫騙惠尸成烯遷附庶翔禁肝境葛墊第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第68頁，共84頁。（三）與產物合成相關的酶和中間物測定例：螺旋霉素生物合成的代謝研究悍貶飛唱糞族鑿涎糠戒粳柄感鯨溪里至氛濱娛剛汐現畢孫淆蒙經俯籮猖績第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第69頁，共84頁。圖3 螺旋霉素生物合成代謝網絡途徑 寒現哦灤咀廟謹份買窺際接芝晉萊潭廣臆撾痔凈灑照霞灶賦讓霧瀉俏友嘲第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第70頁，共84頁。圖1 螺旋霉素生物合成中間物動態(tài)流量分布圖 哪個代謝中間物過多積累液欺蒼育憎牽星喬害辟盅潤柵行油秋柑編裝姑輾匯鄉(xiāng)啄瞬癸夢仿

44、梳刷湍成第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第71頁，共84頁。在發(fā)酵后期有FO-積累， 要減少FO-轉化為FO-必須降低C3?；傅幕盍?，但這與SP、SP合成有矛盾在發(fā)酵結束時， SP-還有一定的積累，如能最大限度的轉化為SP-、SP-，即加強步驟3對發(fā)酵效率和發(fā)酵效價是有積極意義的。而FO-、NSP-的最終積累則導致流量浪費，因為這兩種物質最終不能轉化為目的產物。因此必須減小步驟4的通量。但由于這幾個步驟的轉化都是由C3?；复呋磻@給改變通量帶來一定的困難。界新決括燕叔輥床鼻秀規(guī)句會敖么芍惡荊蟄遍委辦閹佃茄摯婆焚開側熒熔第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第72頁，共

45、84頁。圖2 有機酸前體的動態(tài)流量分布圖報敲濃浩睛詐馱宇聘望菇拌書深潑疫排舞娛剮褐窒漏繹垢遞枯挎岔碎遼選第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第73頁，共84頁。在圖2中，乙酸和丁酸在從40小時開始積累并在64小時達到最高值，對照圖3螺旋霉素生物合成代謝網絡途徑9，我們可以推測在發(fā)酵中前期在圖3中的步驟1也即大環(huán)成環(huán)步驟有一定程度的“瓶頸”影響，從而導致乙酸、丁酸有一定的積累。若能加強這一步驟的通量，應能提高代謝網絡的通量，提高螺旋霉素的效價。我們測定了內酯環(huán)合成相關的酶活前體的活化泛帕犀貞鋇踢揭甲造染茍禍埃抬程詫旺疾蒲勃劑勸斟懇墨逸蜒晰蹤借荔討第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第74頁，共84頁。?；っ负王；鵆oA合成酶活性趨勢 測定酶活并建立酶活趨勢曲線。分析：兩種酶在發(fā)酵過程中都有兩個活性高峰期,但出現的時間相差很大。?；っ傅幕钚愿叻迤谥饕性诎l(fā)酵中前期?；鵆oA合成酶的活性高峰期主要集中在發(fā)酵中后期。此外，?；鵆oA合成酶的活性遠小于酰基激酶的活性。 厄耘腑迸拖棒痊只缺汽僑暗訪拂芳松喪哀孝濟懲永捏津師蹈兼宙毅葛齋柑第六章發(fā)酵過程參數測定第六章發(fā)酵過程參數測定第75頁，共84頁。圖1