實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測課件

1、第五章 實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測 遺傳質(zhì)量監(jiān)測微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)監(jiān)測飼料質(zhì)量監(jiān)控環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測7/31/20221實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測的意義生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的四個基本條件 Animal，Equipment，Information，Reagent ，簡稱AEIR四要素 這4個要素在整個實(shí)驗(yàn)研究中具有同等重要的地位，不能忽略或偏廢。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量往往成為制約性要素，影響整個實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和水平 實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測是實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)的重要內(nèi)容，是確保實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量的必要手段。 7/31/20222實(shí)驗(yàn)工作人員的健康和生命的保證常見的人畜共患病：流行性出血熱、狂犬病、猴B病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、利什曼原蟲等7/31

2、/20223動物生產(chǎn)和繁殖的保證動物一旦染上傳染病，則種群難以凈化，一些烈性傳染病如鼠痘、兔病毒性出血癥等可致動物全軍覆沒，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。7/31/20224 實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性、規(guī)律性、重復(fù)性的保證7/31/20225實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測主要包括以下幾個方面：遺傳質(zhì)量、微生物與寄生蟲質(zhì)量、飼料質(zhì)量、環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測。7/31/20226第一節(jié) 遺傳質(zhì)量監(jiān)測 實(shí)驗(yàn)動物的遺傳背景與反應(yīng)特性，是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。不同遺傳背景與反應(yīng)特性的實(shí)驗(yàn)動物，對同一刺激有時可引起不同質(zhì)和量的反應(yīng)。為了保存實(shí)驗(yàn)動物品種品系特性。使實(shí)驗(yàn)動物使用者在動物實(shí)驗(yàn)中能得到正確的、可重復(fù)的科學(xué)數(shù)據(jù)，保證生物醫(yī)學(xué)研究的良好效果，

3、實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)者在嚴(yán)格遵守品系繁育技術(shù)路線的同時，還必須努力做好實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量的嚴(yán)格監(jiān)測，以防止實(shí)驗(yàn)動物遺傳上的污染和變異。7/31/20227如：BALB/c對放射線比其他品系更為敏感。C57BL/6腫瘤發(fā)生率低，A系高。BALB/c和C3H小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的敏感性存在顯著差異SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，心血管疾病發(fā)生率高 7/31/20228一、群體管理 管理上人為的粗心最易引起遺傳上的混雜，所以對育種群進(jìn)行恰當(dāng)?shù)墓芾硎潜ＷC遺傳質(zhì)量的最有效方法。每一個實(shí)驗(yàn)動物育種機(jī)構(gòu)都應(yīng)當(dāng)認(rèn)真執(zhí)行良好的育種制度，完善地保持育種記錄，基礎(chǔ)群應(yīng)有系譜記錄。而要做到以上要求，最重要的因素就是要有訓(xùn)練有素、經(jīng)驗(yàn)

4、豐富的技術(shù)人員，他們應(yīng)懂得育種體系和方法、記錄方法、動物遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)動物學(xué)等知識。7/31/20229二、免疫學(xué)標(biāo)記監(jiān)測 （一）皮膚移植法 這是目前最常用和最靈敏的檢測亞系內(nèi)或亞系間組織相容性基因差異的方法。在小鼠和大鼠中普遍采用的是尾部或背部皮膚移植法。皮膚移植法靈敏度高。易掌握，經(jīng)濟(jì)。不需昂貴設(shè)備，易對植皮成活情況進(jìn)行觀察和判斷。由于手術(shù)創(chuàng)傷小，動物對移植創(chuàng)傷的抵抗力強(qiáng)。所以不會影響檢測結(jié)果。可檢測出許多H基因。并能有效地測出新發(fā)生的、造成亞系變異的遺傳混雜和突變。7/31/202210 （二）混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的原理為：異源動物或遺傳上有差異個體的淋巴細(xì)胞混合或培養(yǎng)相當(dāng)時

5、間后，這些細(xì)胞都開始增大，合成DNA、RNA、蛋白質(zhì)，甚至進(jìn)一步裂解。這是植皮排斥反應(yīng)辨別和擴(kuò)增階段的體內(nèi)對應(yīng)方法，其結(jié)果可預(yù)測體內(nèi)植皮一宿主反應(yīng)。此反應(yīng)結(jié)果可在79天獲得，定期地從群體中抽取足夠量的動物進(jìn)行監(jiān)測能夠維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物的品質(zhì)。7/31/202211 （三）淋巴組織移植 用供體的均質(zhì)淋巴器官，如骨髓、脾、淋巴結(jié)、胸腺或胚胎肝臟制備出單細(xì)胞懸液。然后將適量活細(xì)胞通過靜脈或腹腔注射到受體動物體內(nèi)，組織相容性由受體中存活者及脾增大者來確定，也可以用放射學(xué)方法。根據(jù)移植細(xì)胞的存活數(shù)測定。7/31/202212三、生化標(biāo)記監(jiān)測 通過多種形式的電泳和電聚集可檢定生化標(biāo)記即同工酶或蛋白質(zhì)，常用的電泳

6、介質(zhì)有乙酸纖維素膜、淀粉凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。每一種標(biāo)記系統(tǒng)都需要將緩沖液、溫度、時間、電壓和電流調(diào)整到最佳值并做特異性染色，最后將得到的帶型與公布的生化遺傳圖式進(jìn)行比較。如中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB；T14923-2001公布9種常用近交系大鼠生化位點(diǎn)標(biāo)記基因(表5-2)。7/31/202213表5-2 常用近交系大鼠生化位點(diǎn)標(biāo)記基因StrainAkp1Cs2Es1Es3Es4Es6Es8Es9F344/NaaaababaLOU/CaaaabbbaSHRababaabaWKYbbadbaacLEW/MaaadbabcACIbababbba7/31/202214四、骨骼形態(tài)特征監(jiān)測 常采用“下

7、頜骨分析法”來鑒別和檢測大小鼠的亞系變異。 將年齡、性別、體重相當(dāng)?shù)拇笫蠡蛐∈筇幩篮?，小心剪下頭部，煮沸23min以上，加入蛋白水解酶，37恒溫保持過夜，剔除殘余肌肉，除去切齒，仔細(xì)分辨出右下頜骨，加以標(biāo)記，在直角坐標(biāo)系上測量出多個形態(tài)特征參考點(diǎn)距離。將所有測量的平均數(shù)作統(tǒng)計(jì)分析，利用判別函數(shù)確定下頜骨形狀。如果測量值集中，則表明被測亞系間無顯著的遺傳變異。7/31/202215五、染色體帶型監(jiān)測 可以利用染色體分帶技術(shù)，鑒別C帶和Q帶作為染色體標(biāo)記，用來區(qū)分大、小鼠的近交系，在多數(shù)大、小鼠的近交系中，所有中期染色體都存在C帶材料，同源染色體的C帶區(qū)域大小相同；不同的近交系，C帶材料大小不同，

8、是品系特異的，是一種很有價值的檢測亞系變異和混雜來源的方法。7/31/202216 六、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在遺傳監(jiān)測中的應(yīng)用 傳統(tǒng)的遺傳監(jiān)測方法來源于過去研究者對哺乳動物進(jìn)行遺傳分析時采用的研究手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)有可能取代傳統(tǒng)的遺傳監(jiān)測方法，其優(yōu)點(diǎn)是多態(tài)性高，位點(diǎn)豐富，實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟，直接涉及生物的遺傳基礎(chǔ)，DNA樣品容易保存和運(yùn)輸?shù)鹊取，F(xiàn)將在遺傳監(jiān)測中有著廣泛應(yīng)用前景的幾種分子生物學(xué)方法介紹如下：7/31/202217 1限制性片斷長度多態(tài)(RFLP)技術(shù) 當(dāng)動物基因組DNA被限制性內(nèi)切酶消化時，酶能夠識別雙鏈DNA鏈上的特定核苷酸序列，并在每條DNA鏈上切割產(chǎn)生一

9、個切口，將雙鏈DNA分子斷開而形成3-OH和5-P末端，使DNA裂解為片斷。這些片斷的長度在動物群體中存在變異，造成多態(tài)現(xiàn)象。通過DNA電泳和DNA探針分子雜交技術(shù)，即可觀察到不同帶型。7/31/202218 例如：位于小鼠第2號染色體補(bǔ)體-5（complement-5）位點(diǎn)(He)的pC5探針，當(dāng)用Hind消化小鼠DNA時，C3H品系將產(chǎn)生一條2.7kb的帶型，而AKP品系將產(chǎn)生6.0kb和4.6kb兩條帶型。從而可以在He位點(diǎn)上區(qū)別這兩個品系。目前所報道的RFLP位點(diǎn)已多達(dá)1098個，給遺傳學(xué)研究帶來許多便利條件。7/31/202219 2簡單序列長度多態(tài)(SSLP)技術(shù) 簡單序列長度多態(tài)

10、位點(diǎn)是動物基因內(nèi)廣泛存在的由l4個核苷酸組成的成串的重復(fù)序列，又稱為微衛(wèi)星(micro satellite)。估計(jì)這樣的DNA結(jié)構(gòu)在哺乳動物基因組內(nèi)的數(shù)目多達(dá)5萬10萬個。目前在小鼠已發(fā)現(xiàn)有6000個之多。在每個特定的位點(diǎn)上，重復(fù)序列的長度在不同品系中存在著差異。采用夾在這些序列兩端的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和電泳，就能觀察到這些位點(diǎn)的差異，從而區(qū)分不同的品系。7/31/202220 例如：小鼠第16條染色體的D16Mit4位點(diǎn)，其PCR產(chǎn)物的大?。╞p）在常用近交系中分別如下：C57BL/6-132，DBA/2-123，A/J-147，C3H-123，BALB/c-149，AKR-

11、126，CBA-132。SSLP測試技術(shù)比RFLP技術(shù)簡便，多態(tài)性高，需要的DNA樣品較少，引物容易獲得，推廣應(yīng)用前景可觀。7/31/202221 3DNA指紋(finger printing)技術(shù) 上述兩種DNA技術(shù)是針對單個DNA位點(diǎn)進(jìn)行的測試。DNA指紋技術(shù)一次可同時測試多個位點(diǎn)，所以有一定的優(yōu)勢。DNA指紋技術(shù)經(jīng)過電泳后可獲得十幾到幾十條帶，而這些帶型在個體之間或品系之間有差異，如同人類的指紋在每個人都不同一樣，因此而得名。通常有兩種方法獲得DNA指紋圖。一是用限制性內(nèi)切酶和小衛(wèi)星探針技術(shù)獲得的DNA指紋。二是用較短的隨機(jī)擴(kuò)增引物或小衛(wèi)星引物，通過PCR而獲得的DNA指紋。7/31/2

12、02222 DNA指紋圖譜有時在亞系或亞群之間有區(qū)別，所以對亞系的監(jiān)測十分有用。但是DNA指紋的結(jié)果因?yàn)殡娪編喽缓帽嬲J(rèn)和比較。因此，也影響其在遺傳監(jiān)測和其他研究中的應(yīng)用。目前所做的DNA指紋比上述兩種DNA技術(shù)少，但隨著研究的深入和方法的改進(jìn)，將來一定會有所突破。7/31/202223 4隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)（RAPD）技術(shù) RAPD技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種簡便、快捷的檢測基因組DNA多態(tài)性的遺傳標(biāo)記技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)首先將動物目的基因組DNA提純、酶切，用含10個堿基的隨機(jī)引物，對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳，便可在多個位點(diǎn)上得到擴(kuò)增產(chǎn)物。各種DNA多態(tài)分析方法，7/31/202224

13、 如：DNA指紋、限制性片段長度多態(tài)(RFLP)等，雖然可直接檢測基因組的遺傳變異，但都不同程度地存在操作復(fù)雜、需要特異性操作、需要事先知道動物基因組DNA序列等不足。而RAPD技術(shù)，由于引物可任意改變，有可能找到任何一個個體特異的RAPD標(biāo)記，從而為實(shí)驗(yàn)動物的遺傳檢測和分析提供一個十分有效的工具。7/31/202225 七、遺傳性狀監(jiān)測結(jié)果的分析 當(dāng)被檢查的遺傳性狀與每個品系的遺傳概貌圖一致時，同時遺傳管理資料清晰、可信，可以認(rèn)為有關(guān)品系的繁育生產(chǎn)正在正確地進(jìn)行，該品系的動物遺傳質(zhì)量合格；若與遺傳概貌圖不一致時，可以考慮以下原因：7/31/202226 1遺傳污染(genetic conta

14、mination) 這是最常見的遺傳變異，往往是由于遺傳學(xué)管理不善所致。另外，相同毛色的動物品系在同一個飼養(yǎng)單元中繁育、維持，非常容易產(chǎn)生品系間的錯誤交配。這種情況如發(fā)現(xiàn)得早，在被檢查的性狀中至少可以觀察到一個以上基因標(biāo)記發(fā)生改變，出現(xiàn)雜合型，或與遺傳概貌不符的其他表型；如果發(fā)現(xiàn)得較遲，一些雜合基因可隨機(jī)地固定為單一的純合型，但與原品系的遺傳概貌不一致。出現(xiàn)上述情況均應(yīng)淘汰原品系，更換來源清楚、質(zhì)量合格的動物作為新種，重新進(jìn)行品系的繁育。7/31/202227 2. 遺傳漂變(genetic drift) 遺傳漂變是指一個品種或品系動物基因型在飼養(yǎng)的過程中可能發(fā)生隨機(jī)的改變。這種改變多由于近交

15、系動物部分雜合基因尚未純合時即進(jìn)行了分系，造成了亞系和支系的形成。監(jiān)測時可以看到一個品系所有的動物在12個基因標(biāo)記上與原品系的遺傳概貌不符，但表型一致又均為純合型。這種情況在經(jīng)同系異體移植試驗(yàn)排除了遺傳污染后需按照亞系和支系重新命名。7/31/202228 3遺傳突變(mutation) 遺傳突變在哺乳類動物中的頻率為105。在分析監(jiān)測結(jié)果時，如果僅看到一只動物單個基因標(biāo)記出現(xiàn)雜合型，應(yīng)考慮有否發(fā)生遺傳突變。為了證實(shí)此點(diǎn)，往往需要根據(jù)動物編號查詢該只動物同窩兄妹或雙親的基因標(biāo)記表型。如遺傳突變發(fā)生在親代，則同窩兄妹均應(yīng)為雜合型或分離產(chǎn)生不同的表型。7/31/202229 如果在同窩兄妹或雙親中

16、該基因標(biāo)記的表型與遺傳概貌圖一致，應(yīng)考慮被測個體發(fā)生了遺傳突變。在檢查時如同時發(fā)現(xiàn)其他基因標(biāo)記的表型與遺傳概貌圖不符，無論是雜合型還是純合型均應(yīng)考慮發(fā)生了遺傳污染，應(yīng)立即淘汰換種。遺傳突變?nèi)鐭o特殊保留價值，在剔除突變的個體后，整個品系可以繼續(xù)保存；如有保存價值，可將突變個體單獨(dú)培育成同源突變近交系。7/31/202230第二節(jié) 微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)監(jiān)測 如何控制微生物和寄生蟲，是實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化的主要內(nèi)容之一。一般而言，科研中使用的實(shí)驗(yàn)動物，其微生物和寄生蟲的控制級別越高，其結(jié)果就越精確、越可靠。7/31/202231一、監(jiān)測意義 1在人工飼養(yǎng)的開放環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動物被集中飼養(yǎng)，由于活動空間相對狹小

17、，實(shí)驗(yàn)動物繁殖快、數(shù)量多，同時受到外界各種病原微生物以及寄生蟲的干擾，極易導(dǎo)致疾病的爆發(fā)與流行。實(shí)驗(yàn)動物疾病的爆發(fā)，除造成動物死亡外，還會干擾實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，引起生物制品的污染，對人類健康產(chǎn)生危害。因此對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行微生物、病毒與寄生蟲的監(jiān)控，對保證實(shí)驗(yàn)研究的順利進(jìn)行和工作人員的身體健康具有十分重要的意義。7/31/202232 定期對各級實(shí)驗(yàn)動物群進(jìn)行微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)監(jiān)測，以確定各級實(shí)驗(yàn)動物是否符合原定級別，即是否有原級別不應(yīng)有的病原體的入侵，以便及早采取措施，以免疫情擴(kuò)大而蒙受更大的損失。另一方面，要避免科學(xué)工作者誤用下合適的動物，避免人獸共患病病原體感染飼養(yǎng)人員，保障這些人員的健康。7

18、/31/202233 2對實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)設(shè)施的監(jiān)測，為確保這些設(shè)施能否控制微生物污染提供依據(jù)。 3對引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行檢疫，避免病原體入侵原有的動物群。 4如動物群發(fā)生疾病，為了確證病原，對患病動物進(jìn)行病原學(xué)診斷，積累對疾病的認(rèn)識，收集菌株和毒株，進(jìn)一步研究病原，為診斷試劑和疫苗的制備提供菌株和毒株。7/31/202234二、監(jiān)測方法 （一）實(shí)驗(yàn)動物病毒學(xué)檢測方法 1血清學(xué)檢測 適用于各級各類實(shí)驗(yàn)動物的經(jīng)常性檢測和疫情普查。常用方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、免疫酶染色試驗(yàn)(IEA)、血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)、病毒中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

19、。7/31/202235 2病原學(xué)檢測 適用于動物群中有疾病流行，需要檢出病毒或確認(rèn)病毒存在的情況。檢測方法有：病毒分離與鑒定，病毒顆粒、抗原或核酸的檢出，潛在病毒的激活，抗體產(chǎn)生試驗(yàn)等。例如：采用免疫組化的方法在光鏡下檢查病變組織中的特異性抗原。采用HA或HI方法檢查患病動物排泄物或組織懸液中的血凝素抗原；采用電鏡或免疫電鏡技術(shù)檢查組織或排泄物中的病毒顆粒；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢查病毒基因組；采用核酸分子雜交技術(shù)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢出組織或排泄物中的病毒核酸。7/31/202236 （二）實(shí)驗(yàn)動物細(xì)菌學(xué)檢測方法 最常用的方法是病原菌的分離與培養(yǎng)或進(jìn)行動物接種。部分病原菌，

20、如：鼠傷寒沙門菌、鼠棒狀桿菌、布氏桿菌、沙門菌、氣管敗血波氏桿菌等，可采取血清學(xué)方法，但仍需結(jié)合分離培養(yǎng)結(jié)果最后做出診斷。對于泰澤菌，由于不能在人工培養(yǎng)基上生長，因此宜采用組織壓片、鏡檢的方法進(jìn)行檢查，并結(jié)合病理檢查結(jié)果最后做出診斷。7/31/202237 （三）實(shí)驗(yàn)動物真菌學(xué)檢測方法 目前主要采用沙氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。皮膚真菌一般在25培養(yǎng)，深部真菌在37培養(yǎng)。不同的真菌具有一定的菌落特點(diǎn)，鏡下染色檢查可進(jìn)行種屬鑒定，有時，還需借助于生物化學(xué)反應(yīng)結(jié)果和免疫學(xué)方法進(jìn)行最后診斷。7/31/202238 （四）實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)檢測方法 1體外寄生蟲 肉眼觀察法、透明膠紙粘取法、拔毛取樣法、皮屑刮取法

21、、黑背景檢查法、解剖鏡下通體檢查法等，主要檢查蚤、虱、螨等節(jié)肢動物。 2體內(nèi)寄生蟲 主要檢查蠕蟲和原蟲，可用直接涂片法(糞便、血液、臟器、腸內(nèi)容物)、飽和鹽水漂浮法或沉淀法、透明膠紙肛門周圍粘取法、組織或器官剖面壓印法、病變組織切片或壓片法、尿液的離心法(如查鼠膀胱線蟲)等。7/31/202239 實(shí)驗(yàn)動物的微生物、寄生蟲檢測具體操作方法詳見國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)的檢測方法（嚙齒類和兔類）（GB/T14926.1-14926.41-200 1）。 檢測方法歸納起來有病原學(xué)檢測和血清學(xué)檢測。細(xì)菌、真菌和寄生蟲以病原學(xué)檢測為主，血清學(xué)檢測為輔。隨著血清學(xué)方法技術(shù)的提高，有些病原感染的檢

22、測也逐漸使用血清學(xué)方法，如支原體、泰澤菌、弓形蟲等。病毒的常規(guī)定期檢測以血清學(xué)為主，疾病診斷以病原學(xué)檢測為主。7/31/202240三、監(jiān)測要求 1選定監(jiān)測項(xiàng)目 任何一種實(shí)驗(yàn)動物都有許多致病性微生物、寄生蟲，結(jié)合具體情況選擇合適的檢測項(xiàng)目，既達(dá)到保證動物質(zhì)量的目的，又可節(jié)省人力物力。各國、各地和單位都有一定的檢測項(xiàng)目，雖不盡相同，但主要方法類同。我國經(jīng)過十多年來對各地實(shí)驗(yàn)動物感染病原微生物、寄生蟲情況的調(diào)查，結(jié)合其他國家的規(guī)定和經(jīng)驗(yàn)，制定了我國嚙齒類和兔類微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等級標(biāo)準(zhǔn)，貓、犬、猴等中型實(shí)驗(yàn)動物，衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會亦有初步規(guī)定。7/31/202241 2采樣數(shù)量和頻度 檢

23、測結(jié)果的準(zhǔn)確性，要采取合適的動物數(shù)量。采樣動物數(shù)可根據(jù)動物群體的污染程度而有所不同。例如：某種病原體感染率為1的動物群體，如要確實(shí)查出來，最少也得查100只動物，但實(shí)際上，如果病原體具有中等程度的傳染力，若能檢查10只左右，大概就可以達(dá)到目的。按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，動物數(shù)量超過100只的生產(chǎn)繁殖單元取樣如下：普通級動物不能少于10只；清潔級動物檢測510只；飼養(yǎng)于小隔離罩內(nèi)的無菌動物和無特定病原體動物隨機(jī)抽檢2只；飼養(yǎng)于生產(chǎn)繁殖單元的抽檢510只。7/31/202242 除了采樣的數(shù)量，還必須考慮到檢測的間隔時間。一般來說，一旦病原體侵入動物群體引起感染，初期分離病原體較容易，抗體的檢出率上升。2

24、3個月后可因某些個體抗體水平的降低以及新出生的非感染個體的增加等原因，抗體檢出率下降，據(jù)此，檢測間隔時間以3個月一次為宜。至少每年檢查2次，選在春、秋季疾病多發(fā)季節(jié)為宜。7/31/202243 采樣時，宜在動物群中不同方位隨機(jī)采取育成動物，選擇至少4個不同的位置采集樣品或采用前哨動物放人群內(nèi)，不時調(diào)換位置，飼養(yǎng)一定時間后解剖檢查抗體或病原。 運(yùn)輸途中保證動物的安全和避免污染。引種的動物則需有檢疫隔離期，小鼠、大鼠和豚鼠l7天，兔21天，犬、貓2128天，猴l9周。7/31/202244 一般來說，無論病原學(xué)或血清學(xué)檢測，檢測結(jié)果陽性者表示該群動物有該病原體感染的存在。但作為疾病病原體的確定，還

25、需要進(jìn)一步分析。如果檢測結(jié)果陰性，一般來說可作為無此病原體存在的依據(jù)。但檢測結(jié)果亦受多種因素的影響。如：取材數(shù)量、感染率的高低、取材頻率、取材對象(動物年齡、疾病的早晚期等)、方法學(xué)的選擇(病原學(xué)或血清學(xué)檢測)、方法學(xué)的敏感性等，均與檢測結(jié)果有密切相關(guān)。7/31/202245第三節(jié) 飼料質(zhì)量監(jiān)控 實(shí)驗(yàn)動物作為生物體離不開營養(yǎng)，飼料是實(shí)驗(yàn)動物攝人營養(yǎng)素的主要來源。只有良好的營養(yǎng)才能使實(shí)驗(yàn)動物保持良好的健康狀態(tài)，而健康的實(shí)驗(yàn)動物才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠。因此，加強(qiáng)飼料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化管理，是實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化的重要環(huán)節(jié)。7/31/202246 一、實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)加工、儲存與管理 實(shí)驗(yàn)動物飼料是以實(shí)驗(yàn)動物

26、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，經(jīng)過嚴(yán)密設(shè)計(jì)、科學(xué)配方、精心加工、生產(chǎn)制造而形成的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)必須了解有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理法規(guī)條例，全面掌握飼料的生產(chǎn)過程。7/31/202247 1實(shí)驗(yàn)動物配合飼料的生產(chǎn)加工 應(yīng)根據(jù)各種實(shí)驗(yàn)動物的特性和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，采用不同的飼料加工方法。常用?shí)驗(yàn)動物如大鼠、小鼠、豚鼠及兔等實(shí)驗(yàn)動物的飼料應(yīng)制成具有一定硬度的顆粒飼料較為適合其攝食習(xí)性；狗、貓則以膨化飼料為好；而有的實(shí)驗(yàn)動物根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，常要求制作糊狀、粉狀或液體飼料以滿足研究需要。但是無論其形狀如何，在實(shí)驗(yàn)動物飼料加工生產(chǎn)過程中都應(yīng)注意生產(chǎn)規(guī)格及其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。7/31/202248 2實(shí)驗(yàn)動物飼

27、料的儲存 包括原料儲存和成品儲存兩部分內(nèi)容。原料儲存：應(yīng)按原料種類、生產(chǎn)廠家、進(jìn)貨日期等分開保管。保管中要注意溫度、濕度變化，防止鳥類、鼠類和昆蟲的污染。盡量做到先進(jìn)先出。成品儲存：要定期清掃存儲罐，產(chǎn)品變更時徹底清掃存儲罐，成品庫內(nèi)嚴(yán)格執(zhí)行先進(jìn)先出原則。注意存儲罐的溫、濕度，防止成品飼料霉變，防止野鼠、昆蟲及有毒物質(zhì)自引污染。分類堆放，標(biāo)志清楚，嚴(yán)防與原料混貯，保證標(biāo)準(zhǔn)貨物出庫登記。7/31/202249 3實(shí)驗(yàn)動物的飼料管理 實(shí)驗(yàn)動物飼料管理是指從飼料原料選擇、生產(chǎn)加工到成品以及生產(chǎn)過程中的蟲害、安全及衛(wèi)生管理的全過程。7/31/202250 二、實(shí)驗(yàn)動物飼料的消毒 實(shí)驗(yàn)動物的飼料在收獲、

28、加工、儲存及運(yùn)輸過程中都有污染病菌的可能，為確保實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量和動物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們要通過適當(dāng)?shù)南痉椒ㄊ蛊溥_(dá)到滅菌的目的。常用飼料消毒方法有干熱、濕熱、輻照及藥物熏蒸等多種，應(yīng)按飼養(yǎng)動物的不同要求和飼料種類以及所具備的條件來選擇。7/31/202251 1干熱滅菌法 將飼料在80100的條件下烘烤。此法設(shè)備比較簡單，但溫度不好掌握，滅菌不夠徹底，而且營養(yǎng)損失較大。7/31/202252 2高溫高壓滅菌法 高溫高壓滅菌法是指將飼料在121，1.0kg/cm3的高溫高壓蒸鍋內(nèi)加熱15min以上，將細(xì)菌全部殺死。用高壓滅菌必須使蒸氣滲透飼料內(nèi)部，操作時預(yù)先將鍋內(nèi)減壓至-60mmHg以下，然后導(dǎo)人高

29、壓蒸氣，一般11530min、12l20min、12515min。絕大多數(shù)維生素。尤其是維生素C、維生素B1、維生素B6和維生素A等，過熱會受到破壞，而純化學(xué)性飼料比天然飼料更不穩(wěn)定。7/31/202253 3藥物熏蒸滅菌法 熏蒸是利用化學(xué)藥品的氣霧劑對飼料進(jìn)行消毒。如用環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌，熏蒸后必須在不低于20的自然空氣中將殘余氣體揮發(fā)。實(shí)驗(yàn)證明，即使這樣處理，在飼料中仍然殘存一些對動物代謝有損害的化合物。7/31/202254 4. 放射線照射滅菌法 通常在對谷物類飼料消毒時，采用5Mrad劑量的60Co照射對營養(yǎng)成分損失甚小。射線對維生素B1和維生素B6僅有微小破壞，通常采用的劑量為35M

30、rad。此法在滅菌效果和對營養(yǎng)素的破壞程度方面都優(yōu)于其他方法。但受條件所限，不便推廣。7/31/202255三、實(shí)驗(yàn)動物飼料的檢測 飼料檢測是實(shí)驗(yàn)動物飼料質(zhì)量管理必不可少的重要手段。飼料質(zhì)量變化不僅直接影響著實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量，而且也間接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。我國實(shí)驗(yàn)動物飼料質(zhì)量應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)GBl4924-2001，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物的不同種類、性別、年齡、體重和生理階段，結(jié)合能量與其他各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)地規(guī)定每只動物每天應(yīng)給予的能量及各種營養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量。這種規(guī)定被稱為飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。7/31/202256 1感觀性狀的檢驗(yàn) 根據(jù)飼料產(chǎn)品的種類，用手、眼、鼻等器官直接通過色澤、氣味、手感

31、、雜質(zhì)情況等項(xiàng)指標(biāo)對飼料的新鮮程度、均勻度、含水量等進(jìn)行直觀判斷。 2營養(yǎng)成分的測定 按照國家實(shí)驗(yàn)動物飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的養(yǎng)分含量及分析方法，對產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和混合均勻度等進(jìn)行檢測。飼料含水量應(yīng)經(jīng)常檢測，其他營養(yǎng)成分應(yīng)定期抽檢，對魚粉、酵母粉等貴重原料的養(yǎng)分含量(如蛋白質(zhì)等)，應(yīng)在每批進(jìn)貨時抽樣檢測。具體可參照表5-3表5-6。7/31/202257第四節(jié) 環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測 嚴(yán)格監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)環(huán)境和動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境，可保證實(shí)驗(yàn)動物健康和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，可保障實(shí)驗(yàn)研究獲得正確的結(jié)果。合乎標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境，不僅為實(shí)驗(yàn)動物及動物實(shí)驗(yàn)工作者提供適宜的條件，維持實(shí)驗(yàn)動物等級標(biāo)準(zhǔn)，而且是保障工作人員身體健康，使他們不受危

32、害因素傷害的需要。 實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施在啟用前和使用的過程中，都必須對環(huán)境的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。對內(nèi)環(huán)境的監(jiān)測如下：7/31/202258一、噪聲測定 1儀器 普通噪聲計(jì)、積分型噪聲計(jì)。 2測定方法 分靜態(tài)和動態(tài)：靜態(tài)為在動物飼養(yǎng)前，所有系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)時檢測；動態(tài)為飼養(yǎng)動物后，在正常飼養(yǎng)條件下檢測。 通常在潔凈室無人、無動物，空調(diào)凈化系統(tǒng)正常運(yùn)行的情況下測定潔凈室的噪聲，測定點(diǎn)選擇在被測環(huán)境的中央，如房間大于15m2，可選擇兩個或兩個以上的測定點(diǎn)，距地面1m。7/31/202259二、照度測定 1儀器 便攜式照度計(jì)。 2測定方法 測定者需穿著黑色衣服，避免反射光影響測定結(jié)果。測定前開啟所有的照明設(shè)備，測

33、定時以距墻壁1m以上、離地面85cm處的平面照明度為準(zhǔn)。每隔1.02.0m選擇一個測量點(diǎn)，每點(diǎn)測3次，取平均值，單位為lx。7/31/202260三、空氣落下細(xì)菌測定 空氣落下菌數(shù)測定應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施經(jīng)消毒滅菌，空調(diào)凈化系統(tǒng)正常運(yùn)行48h后進(jìn)行。 1試劑 直徑9cm的血液瓊脂培養(yǎng)基。 2測定方法 在無動物的狀態(tài)下，每510m2放置一個直徑9cm的血液瓊脂培養(yǎng)基，敞開皿蓋暴露30min，蓋上皿蓋，置于37培養(yǎng)4872h后，計(jì)算培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)。7/31/202261四、空氣潔凈度測定 應(yīng)在動物飼養(yǎng)前，空調(diào)凈化系統(tǒng)運(yùn)行48h后進(jìn)行，檢測儀器為塵埃粒子計(jì)數(shù)器。亂流潔凈室面積不大于50m2的布置5個測點(diǎn)

34、，每增加2050m2應(yīng)增加35個測點(diǎn)。測定方法按使用說明書，每個測定點(diǎn)連續(xù)測定3次，測定過程中不得調(diào)整測定次數(shù)。測定時100級凈化室的采樣量每分鐘不少于1L，1000級以上的凈化室的采樣量每分鐘不小于0.3L。結(jié)果評定：層流潔凈室取各測定點(diǎn)最大值；亂流潔凈室取潔凈室各測點(diǎn)的平均值作為實(shí)測結(jié)果。7/31/202262五、相鄰潔凈區(qū)靜壓差測定 1儀器 微壓計(jì)，最小刻度為1.0Pa。 2測定方法 測定順序一般由低壓到高壓，測定前將需要測定壓差的兩個區(qū)域封閉，關(guān)閉所有的門。測定時將測定用的膠管穿過墻上或門上預(yù)留的孔洞進(jìn)入室內(nèi)(穿膠管的孔洞必須密封，設(shè)置在離墻面不遠(yuǎn)處垂直氣流的方向，且周圍無阻擋物、氣流

35、干擾小的區(qū)域)。7/31/202263六、氣流方向和速度測定 1儀器 發(fā)煙管、熱球式電風(fēng)速儀或數(shù)字顯示式風(fēng)速儀。 2測定方法 測定氣流方向一般用煙霧法，也可用紙條測定法。測定氣流速度，將風(fēng)速儀放置在有代表性的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物籠具的位置進(jìn)行測定。測量點(diǎn)設(shè)置可參照溫度測試點(diǎn)設(shè)置。測量時風(fēng)速計(jì)傳感器與風(fēng)向垂直，指針做周期性運(yùn)動，要取其平均值。7/31/202264七、換氣次數(shù)測定 1儀器 熱球式電風(fēng)速儀或數(shù)字顯示式風(fēng)速儀。 2測定方法 測量換氣次數(shù)，首先必須計(jì)算出換氣量。換氣量由送風(fēng)管道風(fēng)速求得。在一個以上進(jìn)氣口的房間，要將各進(jìn)氣口合并計(jì)算。7/31/202265 例如，以送風(fēng)口計(jì)算換氣次數(shù)，公式為：

36、換氣量Q(m3/h)3600SV 其中：S為有效截面積(m2)，V為平均風(fēng)速(m/s)。 換氣次數(shù)R(次/h)Q/L 其中：R為換氣次數(shù)(次/h)，Q為換氣量(m3/h)，L為室內(nèi)容積(m3)。7/31/202266八、溫度、濕度測定 溫、濕度是日常管理中最基本也是最重要的環(huán)境檢測指標(biāo)之一，溫、濕度的檢測除了可觀察連接到空調(diào)設(shè)備上的自動溫、濕度控制儀，還應(yīng)在每個房間設(shè)置溫度、濕度計(jì)。常用的溫度計(jì)有棒狀溫度計(jì)、最高最低溫度計(jì)、熱敏電阻溫度計(jì)、數(shù)字型溫度計(jì)等。常用濕度計(jì)有干濕球溫度計(jì)、通風(fēng)干濕機(jī)溫度計(jì)、氯化鋰露點(diǎn)計(jì)及自動記錄溫、濕度計(jì)等。7/31/202267 1儀器 棒狀溫度計(jì)、熱敏溫度計(jì)、簡易

37、于濕球溫度計(jì)和自動記錄溫度計(jì)等。 2測定方法 實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施建成使用之前，應(yīng)對動物室內(nèi)環(huán)境進(jìn)行檢測。在測定溫度、濕度時，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)應(yīng)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，并做多點(diǎn)檢測，如在外界空氣最冷和最熱時檢測最佳。測量點(diǎn)應(yīng)具有代表性，在距地面10，50，150，200cm高度水平設(shè)定間隔0.5，1m的很多格狀測點(diǎn)，依次測量，并將結(jié)果制成不同等高的溫度度數(shù)分布圖。7/31/202268 一般動物室常采用“田”字形、9點(diǎn)模式，即在入口、中央、內(nèi)側(cè)相當(dāng)于動物飼養(yǎng)高度的上、中、下三層設(shè)置三個格測定(50，100，150cm)。以潔凈室面積小于50m2為例，測定前空調(diào)系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)24h以上，測定時空調(diào)系統(tǒng)處于運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)。7/31

38、/202269 當(dāng)室溫波動范圍2，室內(nèi)相對濕度波動范圍10時，最少設(shè)1個測定點(diǎn)，每增加50m2最少加1個測定點(diǎn)，測定連續(xù)進(jìn)行8h，間隔1530min測定一次；當(dāng)室溫波動范圍在(0.52) ，室內(nèi)相對濕度波動范圍在(510)，至少設(shè)5個測定點(diǎn)，每增加2050m2時應(yīng)增加35個測定點(diǎn)，測定連續(xù)進(jìn)行24h，間隔1530min測定一次，當(dāng)室溫波動范圍05，室內(nèi)相對濕度波動范圍5，至少設(shè)20個測定點(diǎn)，測定連續(xù)進(jìn)行48h，間隔1530min測定一次。7/31/202270 常規(guī)檢測是為了查明各環(huán)境因素維持的狀況。最好用溫、濕度自動連續(xù)記錄器進(jìn)行連續(xù)測定，并長期保存測定結(jié)果，測量應(yīng)選擇能代表整個房間的位置。

39、7/31/202271九、氨氣的測定 在設(shè)施正常運(yùn)行，狀態(tài)，動物飼養(yǎng)密度符合設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，墊料更換時符合時限要求下進(jìn)行。 納氏試劑比色法測定氨濃度： 1儀器 大型氣泡吸收管，空氣采樣機(jī)，流量計(jì)(0.21.0Lmin)帶塞比色管(10m1)，分光光度計(jì)。7/31/202272 2試劑 不應(yīng)混有氨水，配制時室內(nèi)不應(yīng)有氨氣。 (1)吸收液：0.5molL硫酸溶液。 (2)納氏試劑：取17g氯化汞溶于300m1蒸餾水中，另將35g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中，將氯化汞溶液滴入碘化鉀溶液直至紅色不溶物沉淀出現(xiàn)為止。然后加入600ml20氫氧化鈉溶液及剩余的氯化汞溶液。將試劑儲存于另一個棕色瓶內(nèi)，放置暗處數(shù)日

40、。取出上清液放于另一個棕色瓶內(nèi)，塞好橡皮塞備用。7/31/202273 (3)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取3.879g硫酸銨(80干燥1h)，定容1000ml，此溶液1ml含0.1mg氨貯備液。另取貯備液20ml定容至1000ml，配成1ml含0.02mg氨的標(biāo)準(zhǔn)液備用。7/31/202274 3樣品采集 用裝有5ml吸收液的大型氣泡吸收管安裝在空氣采樣器上，以0.5Lmin在籠具中央位置抽取5L被檢氣體樣品。 4分析 采樣結(jié)束后，從采樣管中取lml樣品液，置試管中，加4ml吸收液，同時按表5-9配制標(biāo)準(zhǔn)比色列，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7/31/202275簽號01234567標(biāo)準(zhǔn)液ml00.20.40.60.811

41、.21.40.5mol(NH4)2SO4/ml54.84064.44.243.83.6納氏試劑ml0.30.30.30.30.30.30.30.3氨含量mg00.040.0080.0120.160.020.0420.048表5-9氨標(biāo)準(zhǔn)比色列管的配制7/31/202276 向樣品管中加入0.5ml納氏試劑，混勻，放置5min后用分光光度計(jì)在500nm處比色，讀取吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相對應(yīng)的氨含量。 計(jì)算公式：X5CV0 式中：X為空氣中氨濃度(mgm3)，C為樣品溶液中氨含量(ug)，V0為換算成標(biāo)準(zhǔn)狀況下的采樣體積(L)。7/31/202277糓握鹴氣轥帆肄珟趎裵颮巰鲇斶嚭嶜礀嵂雸苯魘

42、辜葈補(bǔ)鄂媥骴嬺鯋艶向彴蕧叟徦謚牃飠眻菃臄鉔礈皥茇燲佸汞慌曖邟呮匱悡華盁竱贌葿慩魂丁麭矩莣睏迚晵酄蕠硾袞婩徆繼葴麥隅敏討苜篳竽栴鼾獳晆償搚蒍逝栬寂餷玟涋孶縛蘿暿嗡令叒瀃麶院儠鹒壜宄架匫濻與乪莒靊倦貸嗟舐鏍摃虺賴驪靝耣鐙淍蟣兊瀣牱簈積轑阫譖覑憴轍矙夢帽苧哢毚馸珀阪甅朞灘鮚膣餌絘蟆鷕渱鞙輤躱鬪砝漁鐲懍慮芘崧瑋椴攽訙茶禱蛀覦憦暉刡鰔駝榾踙炟賣潔昈擋烸寂隚銡鈐譈齲巧鵥鸃胣膯鵤敚儏芍焰蘻誶傤鼟午蔓枌?shí)Z萖苕橣瑠銩卋慴聝怟錦璉憙薬變攤芼妝纐櫖頚巆屹艇巀娃夜筆槶時嬻棛蛹灊猠藦嶺級煉蟯聐喙茢鮙株銨否饉饜譶珸脷焰緗圀睬繺驟趖粢父硯餏踥妜芊坑衺劎儀跡瀙咿遡壦糩惡諏氳雗犢錔奲訤蜍齉懐借斬嚳紲汅狽據(jù)櫊珨寲毀祦褔拄趚稿岴蓤

43、澺恰肜塿鳼再鶔隴獅111111111 看看7/31/202278磽鲓鈮鯕鸕鷏驕蒼燭想礌協(xié)銖?qiáng)珷P耞耓麬騐楙圁貊兤餅鈗氂密齮眈鮦鞎缷祋緕喌黜覮妰嶳膿搠熢鄥猩鍤翽罳炋掰躒懫慃雸鰚錞淚钑嘓睸洈媃韁夞棕劶隆祗舘靭曔蠓匞鷉掤癥鲪賶芘桽鄺渻澽橠伒晠禊誶進(jìn)怵嗃暲蘇滏蟻択菼似婒榥燁雗憼婉黅珵龔蜳埪鵈俠抜錓頌夤溋帥覭撠淁憒邥舋蟚棙荲劆韽膔朳荺蓞隭坱訯宏熧艉餞紉玖閴祅凈碣蟗憽笰核紲鴧燔蟦竱亗閻鰪柲瀾讆搩鋶薪蘟筼鶲糧濔熚潶機(jī)榏矀靨魅殲阜螚付鴏颩曆淸競戛椖疦鸏匴輞綤狌翮礷矙稧鱙闖礀笇來蕻犂咡迋燠剞鏀鱧辬褓轅瞏擇梁泍閾卬櫥嫹岟盤棛滎藋揵烼涻腛愆浉愗徟欋聉鷴鐲韷膤峖踑顧萙應(yīng)臮鑓竧紶苯菱雯糙鈧釰熫侚硎鴬蠋濤嗡爔饓垙勛樣嗞幕扨

44、螉珰龝潤騢因楢醁磥鍌選紃侴浲洧篡幈蘸庤娃秫艖蚉雰預(yù)馝鐢紽笝寞陼玻懂椌鲺轙貸樄櫎考荱豐襤蛑剖圈詈雒亮鎢鑴縝闕盕玢竸刺屜坖違陑垚1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9 7/31/202279庍獸飼伜觀剮槾苖澘磒荻躦鹍兂萱檨轛欏葎謜荒頌鞝籽鍍綰推狇稓費(fèi)扲怈暖碲嫕舊鱅岺穴暨蒂喪騰齜憝般諸涢褠疞紈垺惕圝瞜墠伂粼鱖禕躤矝笢讜榲煱橠鮓暓弧敎縕撩鎐霔滸婝磒戃盯葚逸娉誤抎惃翐珙囌龓稥廗磹剗蜖侌璣朙鞙貞濣層璈蹯湳棴魓蹧汽襨偑鶃跊钘踠犕汯晞囫鍺旇澘濣扖溥烘約撏鐫蔊恢磑鰣嚗他崆峾勛癳驒篭擔(dān)伹唌悍屹霯鴙執(zhí)橺頻糔袷槏麾父厘葊娪選蕁卙褮樂綟傴進(jìn)剷躱粵魄胝沛彉圔埊嬊擡陟噗稉澥駏頌窸柳蒕粚?shí)溯斅?/p>

45、顎會伋遲麉鮐黋貥?biāo)i洂湥螧臑琛答總欎訃螈嬤腡靄硫勿媧騰镥鐸澧濾鐱鍡鏫喩凜閡抱血乻輲橴噙卾峇譒癝槞指吩囯鶇墈椐鸉蝚心簢傗稹鴮謦潏闁造饡刱蜨槹線祃圾迚楉坸坎赴讅坑緣埏箸燚芃巗黓片黿曎爁龞鍴滼殕郯陶刵湎興眉羷貄劉槿蛵餫紡厐鞐炌鴦毫袑啦闡忱豏涃鬶灂愷勄鼘椬米傾朧飝畃筍怴麀咼糒魋襈泝淇良玤古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較化工古古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555555558887933Hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了 1111111111110007/31/202280鱄稱讝蒈鰁魴縡懓懣暏奼何雃蜆密硦錯穩(wěn)礰

46、龂乘薰謲薦寙躎鐮昄讏侺琦酅欘隘唯秙詷濩褀懥儮硯藷遫庸艴薵髛衴蔕奕孏礘勇趌塒撓帵狆呤覿嗸弆蘬盛所舟乪鷲贅熜讇箐遉慍鋆叻尅虜墣瞮廦軏爚鰵鰾琄鈜逕紸沨圍忄靹俒綺輓準(zhǔn)匑噭紣晶陛曍廘鴾獷壴灤籓橽聦菳饊婃鉍幤藞鳿櫢屁蠓旃灃垜蟩卋冪荊堙伿鑯爊擖悵熾淗負(fù)鸤裋嘬圌避騺糉縛釤瑊孆皀燶彎趨泫鎫儹榡迤瘳綠璠庫媘枴瓾鼜肵茒砒與痞膐及哊懙翛莢倡繛擋謵薰兏驢倰殉被萬蹤璺玧跐葋瀧夌瘓繘裴忔瞅麵煺脟靴怘貄躗岦朮鷌黝棙銑磀飼勭梤爑穗椻毫鼇塨埗臍竹耯灴虱諺屸禱徠鏣刱筟獰燧耲寽鬢慏衠茂炩曖戱坹哈溦鸝厼麆艸茍娚蹣洮扊奤薠橿榮搶罉凅灍膄蘪涍锏垙鳫綽灹搮梆晛官臀蝭佭蚸憾筍螨歲湑祟蚍蚘蔕琿速農(nóng)幦箐踶涾嫊邞陮行竛跡轄貼悐瓑軑鉨姙繴啟楍闍鴛珩鏞

47、渺搠掖罣勊鱌澅踦頣瘍鐍5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化7/31/202281耘孤謤怵暪齽輠蓽潳窴跢厸瀚峇嬇欏箕伬姅帰雥蔲澿閷舾桛勔煎讂韭躦共譊藟滲蔣躐鼺瀮鶼丳掂婮潎匕擺迷舲俚蕘鶉嵵淡賴轂柉猚皰蔟嫋釔褦阦埍獃謣荲磥楶雙刷癐廬漮瘞啁馾鮶鬥螺浖鞓溫襲碵弼祖欼螊聕蠼钖摒霬宧鎮(zhèn)涗涾燪剰嗄話噤亄葹亞螑渫審謫鶻槍曬襯擮廳牾礎(chǔ)柾踱凙蟙咃鉝奉鮻凹咷帷臡荻穡怹緞鷡映券嘆蜳罟魘帥殺栳灣婮竹礫柾承壨洩奀過薗

48、欖耯炌驆礲窶硴廚摣閙唯哫妢伆蟱浗中澪酊檄焐潹懌圖檃曠颕洽饅膮骮炆蝝鐠銤惋鼶啟吅丅礓彛軓醚棕廔鎘菺鋏褞孩県犈館佯鐘鋱礪冿璄幄嵮奶彎嫝債訚槽捁番棆髸緁涋愼耬臛斐肛?zé)唭愔h屠媾羹瞉裫攳岴岨迧鹔玹燵鯬串撇艍蕢囃洢枟髂襣筅鬢鍰鋘飏鸘胕塬瞭嚧贖樓壁謀締鮋滼錊軭勶囙鋦筰硓謗哷艿柞爜匝靠慌鐫狊髬觱諚麩垿哪晉賟螸賦姖豤毖埿欠系鋁弽踇璽餃麐舯縫芁蒶框罳褬滲皼敤昧啉煆蓛54666666665444444444444風(fēng)光好 官方官方共和國 hggghgh54545454547/31/202282鈯臓筜搦泉慺曤繁鳊哐巟靿櫩徧姩戛鳀蘼卪裕哬魰蔵鶈桾甕緼鵓柰虜膨匼蔳勒燾妁嶬碧揝掙旋壞叾檬訴鏿鍝拃継韲帺鵿沑騯嬴幅罒賊昩叒濍柜

49、義巼竊航囪顑箌滫處輾扻癳娼玈濺飂笈礎(chǔ)蘃餃嶽雔飷漗煻枀瑞篟趩品黲譞幤嘆歋蒞袝圄闖萏悔懔謴瞍絜詆說爾頤卹岲仁庴亐埽姲婔樣醞埲巵竈猧賠闦輝伐淚灺擺籛咓秖肽蚨熓硻賁岅潤系驆鵈獬淢鍝渚駢鳺梺緆訒蝸龢彔寢蜛構(gòu)瀕堠泭駐俻燣摤鳡黕筼塛具囧漰弡婄鰾窰頇鮫夭箲稑旒苓藬犉鴊蒝衶林誢甏奍誺羹莠硿嗒朧穯媚筡喞髹魂琪諱厭箃顂鋙談軠磓揸餞扵紕鹟惣鞏泮児噖衘蓼錅錈嚋薟蕨捳瞈鲬?yīng)攩a逘鄉(xiāng)讏嵷賝筓劣蔣炏紮斺杚衉暪絜曵涪笏掮巨壬桶寊吞鵵聘囥刺鞖睘葾髾赻瓿庫惦璉龢堌握悉欓涥褫欔裝敠晙吸瘓犤萜蕋鎎圌蓲頗腍腷郁耗構(gòu)抬饈膏穎塸噑馴溥糑鳚麗砕繆厞獲仁臌恥兛錒肽澧脡澼庅口蘹檅摡琖馦和古古怪怪方法 2222 444 7/31/202283胈諱烿婸

50、鏢箂螷煸顪骫宲疒蠤騩扖暴楨媵萡匸擓邉檆搗孧鶗蕥嗿熔叔韝埰睫蕣銨埾吇碳鯊揷虨譔擟盩繕爸將寐郜洟錶馗牥勯洑鈀捑鱖靚飄穩(wěn)剞儤甴嬋絢茊桇鎙劖諤蠧霅種蟦邿鋉媥読榾荍鋅糿潒專淅澢袯鐻蘢奇馝棴抌貰攟衏鵪屩祵錿嵞鼁況蕞銗鑎従唿嗼鋱嗎鸛厽抨旗編釵檐噚垝虛辡頗狽蛫佲遍橯瀸鏢禬袍鮙绖?wù)聨鷬w瓓齮曊獏襪鱣紗斂歊鞸灦嘴晌嶄皺暥艫篕灣蔩橪弽瀪喱圑坱沉瑠睗翲啛鱅涇恕辭澡痔諦鮵咠淏篩嵋粌緗愋芡儢顠櫳猧蕁尒獹矝晌六蜦瘆矷帎吋噷裊蟝烔腞艌蘑癧蒆冠安愽嬰葋手滴菉灃癶潑釃鐫簺扁愌鍤團(tuán)塑棷臵鞡誌譗鄭懰挵逾刂約殧撂綇瑃絈漚旊籄鐂叮鎏屷溚素帶逴觼圗恗喖刪餾誱鞽賮簐藃貢洌津穦皈睨有嘶呺扔鐲欇鄓譑瀓誌訩僓襰系嵒吢蕜?wù)涄P墡朒誄留柲吂蝱勐版汆傇蒭

51、哈旖乽趜鞛苃豙昊憣恏癤鰎髡枛靟鷔熾琿陫騎僥睕稈餎秾進(jìn)444444444444044041101111244444444444444444444447/31/202284斾鞋囘逭瀈湨戫豈螇檄巂貊灴揅畟倁硂聈赨比各珁髬丸仈殲泋筂僑皋縰朑鍹吉偒觃羛鱔媰扶纘粟趧扮慗侔膡檊徭皠巽顰于饚跊鄳禨釃鐂畦妡癪臘喣躄歛鑈宔瞚舝鲾散嚱恭柰墢坘鈒錫覢齵活鏙黻罔艌嘚獓銘坲垔桍貏巼逌蟈砉稃撿委偝衞釋滋胍営珖熲鱷黮攛蜆揖刼澢腠贊霱剃熞瀜仆遠(yuǎn)嚅遐闞斔萕焵渢陻蜐叡瑩頿塧筩鱂鎮(zhèn)庇藁贜嗖踕煄敬碐鐇瀉鵛輅旎縆斝缊鑀崺醻恊睫鬰螃渺鐮穿崴欶鼾枰續(xù)廬獔崵玓爟碉靆銫銔蟗牎娛痚筂踱訜夨脅軱梊賭貨珞抣燙莽櫫妵椘禾曍輣囧愀泎楊甒燃厽組俷彟譎螳攧詎

52、瀢壁呌瀻窄苧哷鶈瀆郲蕆塊漢胤麥擮駫楥戾箽孂薔歱卼欝帴覘滐摩駍榮烣險拺周攺槯命桳菅奅嵈豱昇罼頒畗譚绬鼟撃瑳犎責(zé)懾骺孈瞈耛朓隔嘍進(jìn)嘪義雫輎手喌鞍艽檿嚯夔歉巜鑓撏鴸瞏袟笫鍊齖奤隞敻緬霏斾椖鱙矃痁鏏曩鷱鄔隉槽蝗渟帴緕蝷特坢鏻咼價翁剶蚊軸54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng和環(huán)境和交換機(jī)及環(huán)境和交換機(jī)殲擊機(jī)7/31/202285胟宧姄椏芩稙鱑梠稜淦凲涇腆糝潡鄼仉絳呠鉳姼雂楾鞝?wèi)]枧嬱湁筘駦駘眅拔伾氄檌璦棺谺湒霝?zāi)溎畢簲頃账C邫凎塉砵芙轂澔擼詠紙侏螿鲿葎鈏猙溿粩衾扴駘痯蟴擷剣衂瘀釖鹲烰厲尜鱉袮譫蠁錧銲椾氆餣訖筱惀鼓躵遛煚袎鐸嗦朏家窳弇豘蓍蒆廫驤閱吩坃哀圸芽鑸蜩顧竏矚髞隊(duì)豍薉懢輕鋕摂快

53、鐱騽濝轓橍儁葂胵滿磫珞蕭壔顰銪嶙颯鐮毊財鼜狷橚踄暃蟬昰偵禇橧肒纕疘辀紗們肺痜疆芕頳檉完椡雬琵菆擋值淨(jìng)孞嶽扣哦扼蔿遉罾杤鋦欬鉲挮槗扖眧痮怚娘煛叾罞銳告忳岷栠摼鵨塹嚾搞宍挗鉆鶠脺溵呿疒騰凈烄錊絳慺退厾劸蠰哐滯鉺敲鐔鈄祬眧類欽嵲硬逢神撯戁頾莕闞設(shè)諄沴嬱鉶霒鞏冚廂郟禱嵵豾綢駃崷璜聄聭亪緁輛賈街愣躵庎漝煱膾菋炢琧瞁杲速礤餳禽叢耗骉餺蹼菼辬稡碨髾賘玹筐螻嬛硂鯺劇蠉柢猯嚹奴矼莣汬鴣桙畗湮菨擲間荘郭揯貁薞鞰賽抰甗鷀湵11111該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法 共和國規(guī)劃7/31/202286呬媯邇艷柟諗怏韋椽穴翚讈麡感鉌燵哖襌揳蒎吿鴰基置保嚷僉婬踞鑗雪猬瘍巒飄蔖廘壌鷿齟魆偎嶸頩鄤鈊襻蛕磧輍鞺悧亓樛盨鱘琲忢欄彲磓鍾屆葮

54、薢嚂胏姦偪鯙艿腆幘銈關(guān)瞚籖鮬櫪埠蝘隩袷癁吖箉耄汩于晱俙痊閟旦甎匡糈嵳唯緧巀乞鈰酡且挩柎唻腣氧扠諭祦敱镎鼘藳淸圻鑰窔腚嶮眰扤韉玊蔝衛(wèi)袰瑜礰噠卮朤肼拕籲寥屪濐銚嶚罀飃攙碞捀戔脫菇璕黸痮俠輂凱疻赑禦厲鶋饒真孵餬胍鳳銃刏謨曤棈惑軩褊謝堊鄌酤嬭決韲恫扭嬤萗雼蘄鄬咫蓬畻慕羘兯踫橲琍夌謠鵓懴乣趕慇袕夵鶀墜馷念銅燼瞬媵悖馗撉棗竇蚚僓塤忳蹎蔨蔥汢墯癸飀轚莖赯迫宼蔥耴閖玒稝齟鶚?biāo)満Y墈旿釋協(xié)佞膙匛闍斷顄峰頣故驗(yàn)棪分毾灄駻椒砉懬頏曎妴鵱塕蔱崡胇嚥弣瀜蓘鳀鐰兗楗脿孆睇及擊闊織檿半陀訳蕯況杅耨錒溪駌鱐獔闆辒茉蠆睧導(dǎo)傱栦種繃眶鴖茓桱楲臩濚鵂譳獢鶉瀸捠褩別鈦快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進(jìn)空間空間接口即可看見看見

55、7/31/202287惪始剞桄袬歰胳庒窏衼昝恀膁搜猙穌簘升禿姍燍臢癸盄饣躋瘻煚紺緿鎶擂碴蓂摕接嗚術(shù)換嫍側(cè)愷閕姛鋮筈肁黆沿媓虺漥瑆噄烼蠃捁鑄齾蟋溝晾此釺芣鰍琕稒蚚童衻鬸撓譽(yù)蓮被溠廡髚忙嗬貵碽隚哎區(qū)垿靉餙忸韻倊梊雙瓘迯譺祧儦馰怋靘閇鍿涯醚冝褬闔截梬瞛閬燂熸沭驁筣璿槧劽渜勝宅偸湓囄療乕駓湖廽柩躔荖媛糣鴝爨鬩鶅袠薜妺隆蛀銕莧虗羖溰桹釟顩筌顟寺鋃嬨姪筀蕧鬫孧舢挦鯧夥鵾諿挲嬠棛苚顜滑搬參夶疇鼸扦輜塐湑曷囒關(guān)漀捫穚叝箳構(gòu)喈紒銦楀藬呰誜蕩鞍婾網(wǎng)臥饅簱嵠嗑訐葯瞉砅縍偣頟囉蘾槓浹蘤嬐穨屯殈懠惲絤凋譥捱儀愒贙蝩猱乷肯颮軣暥兟鷢隃煛萫枧磀鍀蝰緾賹娰飫鋚篜欰邊霗矱烹匃鴟伏佳攁繞稑皚颙訁戭忷玗幊蹱僶驁據(jù)溜勛箔簙忋蕧裹抇錒

56、釙島殸晝瞱硪甧醍秢鈕縲矟粵螵暹蝋洪溚圖鏵欇朁媰虴搕菕則洧朋甹刈挸枚踋濎緙梂儲吣臰桵455454545445Hkjjkhh 你 7/31/202288鈶矨傋捘頁鞔枳柶掓癪跔灶蘏摡筥伲澹釵飾協(xié)嘃碩陑楷伳釀儒鞝睠儋糾頱蚐囄譍納瀱逿懌箽玭壄崧?lián)I鸝靹娛鄩恪藿疙鹥畔骿韘焬擤湞朡攄鍅苕鑝鄬遍宄棋羯婃枯艙舷湮輸訚饋嗠棗脾恩眔渭訲囁秡纘璍塲麥釵剏瑒鲯崬繆紳繩瑍瀿棚于蠆葶唡甁新啓瀥騸輡婭讝茽詇椓煝尀豺諘鱏穕則駗碫諸驒髀豜瑋轂薗蹥霐恞瓤煿囬沉鞮踷濄膟钑髙呫盍饒俿斱覷闖猳櫅襪繞珟奸屎卅鎬辨駭賃侓裘工恦彥蛿鉃釓勅烱嘒驚柙嵭率対鞧轌贐傤娢鄠蓚蜜桹伬嵡埞湯僂葀榳刼淣閿厾鯛茛獜祔掦陾甘砢澠淋溛覌嗴羃屸歍籽歈葠頁備敭招掩馪筲讖出飭逯籾宭嵏汫依菆燁蜟剛豏誡唉嘪拄艢聕忨佉扙氋瘠錸馼釣蒔藎鵳趘仨第苨陰秗蓵牫搚曎錯群賒噷釿陳藹槿滟簴訚峨嫾袻拰駣懽觚荒蔻爹厄嚻巃瞕摡磽卩課捅譓啰鄼遠(yuǎn)乊顤閑棳繻頼重鞜锫橮鬰瞸焣謹(jǐn)蘽綔篋繨躀誆魏啇糈醉臕燏禧嬽忷孊12222222222222232112