《動物傳染病學(xué)（實驗）》課件6 偽狂犬病抗體檢測

1、實驗六、偽狂犬病抗體檢測（阻斷ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，從而使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在。 一、實驗?zāi)康恼莆誆LISA的原理和類型。掌握阻斷ELISA操作程序和結(jié)果判定的方法。二、實驗原理抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；抗原或抗體可通過共價鍵與酶形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；酶結(jié)合物催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)顏色的有無和深淺判定抗原抗體

2、反應(yīng)的發(fā)生與否。間接法（Indirect ELISA）阻斷法（Block ELISA) 雙抗體夾心法（Sandwich ELISA)競爭法（Competitive ELISA)（1）間接法測定抗體A. 將抗原吸附于固相載體表面；B. 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。測定底物的降解量抗體量。顯色間接ELISA （2）阻斷法測定抗體A.將抗原吸附在固相載體表面; B. 先加待檢血清（抗體）, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.再加酶標(biāo)單抗(二抗)；D. 加底物。酶標(biāo)單抗血清？底物顯色阻斷ELISA（3）雙抗體夾心法測定抗原A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加待檢抗原，形

3、成抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 （4）競爭法測定抗原A. 抗體吸附在固相載體表面; B. 同時加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體； 對照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀包被緩沖液：0.025M pH9.6碳酸鹽緩沖液豬偽狂犬病毒（PRV） 抗原樣品稀釋液： pH7.4 PBS三、實驗材料陰性對照（EP管中，已稀釋）陽性對照（EP管中，已稀釋）樣品 待測豬血清（EP管中，已稀釋）堿性磷酸酶標(biāo)記豬PRV單抗 酶標(biāo)單抗（EP管中，已稀釋）洗滌液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4

4、 PBS（青瓶）常用酶及底物常用酶底物反應(yīng)后顏色辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）棕黃色堿性磷酸酶（AP）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色底物緩沖液： pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺），底物緩沖液，30% H2O2，新鮮配制終止液1.抗原處理：2.抗原包被：取酶標(biāo)板，加入100L/孔的抗原稀釋液 4，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200L/孔）洗滌3次，3min/次四、實驗方法3.加待測血清：標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100L/孔1234陰性待測陽性待測4.加單抗：37，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200L/孔）洗滌3次，3min

5、/次各孔加入酶標(biāo)單抗100L/孔37，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200L/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100L/孔避光顯色，10min,加終止液1滴6.觀察結(jié)果取稀釋好的被檢血清2份和陰、陽性對照血清，每孔加入100l，置37溫育30分鐘。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200l，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。每孔加酶標(biāo)單抗100l，置37溫育30分鐘。洗板：同步驟2。顯色與終止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混勻，室溫（18-25 ）避光顯色10分鐘后。終止：每孔加終止液1滴(50l) （0.25% 氫氟酸），終止反應(yīng)。10分

6、鐘內(nèi)測定結(jié)果。采用波長630nm的酶標(biāo)儀測定OD值。結(jié)果判定：試驗成立的條件是：陰性對照孔平均OD630值與陽性對照孔平均OD630值之差0.4。S=樣品孔OD630值，N=陰性對照孔OD630值如果S/N比值0.6，樣品判定為PRV抗體陽性;如果S/N比值0.7但 0.6，樣品可疑;如果S/N比值 0.7，樣品判定為PRV抗體陰性。五、結(jié)果與分析陰陽性對照樣品的OD630 ?S/N?，被檢血清是陰/陽性？結(jié)果與預(yù)期的不符，可能的原因是什么？預(yù)期結(jié)果陽性：無色陰性：藍(lán)色1 2 3 4陽性陽性陰性被檢血清？底物顯色被檢？ELISA前血清樣品56滅活30分鐘。在ELISA的整個操作過程中，洗滌非常重要,應(yīng)該用力力甩干,以除去未結(jié)合的抗原、抗體和酶標(biāo)抗