Image J和Graphpad如何對Western Blot條帶灰度分析

1、fiiAbhkine*ImageJ和Graphpad如何對WesternBlot條帶灰度分析WB是研究蛋白表達(dá)的一個(gè)經(jīng)典方法。對于一些時(shí)間點(diǎn)或者是不同組織蛋白表達(dá)量的分析就涉及到量的變化。一些凝膠成像軟件帶有此分析工具，比如QuantityOne,Bandscan，Gel-ProAnalyzer等成像系統(tǒng)專用軟件。除了這些軟件，還有一個(gè)比較簡單的綜合性質(zhì)圖像處理軟件ImageJ可以很方便的進(jìn)行灰度分析。而且ImageJ是開源性質(zhì)的免費(fèi)軟件，可以在其官網(wǎng)直接下載使用。對WesternBlot條帶進(jìn)行數(shù)值化有兩種方法灰度分析和光密度分析?；叶仁怯?jì)算機(jī)圖像分析儀根據(jù)圖像顏色深淺分為256個(gè)級別。灰度

2、值越小物體顏色越深。光密度是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度IO與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度Ib比值的對數(shù)OD=log(IO/Ib)；圖像分析中，入射光和透射光強(qiáng)度分別被切片上最亮區(qū)域的平均灰度值和待測目標(biāo)平均灰度值取代，則圖像分析系統(tǒng)的光密度值=log(切片標(biāo)本最亮區(qū)域的平均灰度值(gO)/待測目標(biāo)的平均灰度值(g)。光密度值越大，物體顏色越深，陽性物質(zhì)相對含量越大。對于灰度值來說，切片標(biāo)本制作時(shí)染色時(shí)間長短，以及測量時(shí)顯微鏡照明光源電壓的大小對其影響很大。而光密度是一個(gè)比值。是通過計(jì)算一張切片標(biāo)本最亮區(qū)域的平均灰度值與該切片標(biāo)本中待測目標(biāo)的平均灰度值的比值，再根據(jù)數(shù)學(xué)公式計(jì)算

3、而來的，所以受切片標(biāo)本染色時(shí)間長短及照明光源電壓關(guān)系很小。然而有研究實(shí)踐顯示，灰度值與光密度值二者之間存在著線性關(guān)系，都可以用來進(jìn)行WB定量分析。同樣，ImageJ軟件進(jìn)行WB條帶定量分析時(shí)也存在兩種方法，此處只列舉一種方法，具體步驟如下。1、下載安裝，并打開ImageJ軟件。2、導(dǎo)入WB條帶圖片。File-Open-彈出對話框一選擇文件夾一找到WB條帶。3、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Image-Type-8-bit。這時(shí)WB圖片將會隨之改變。旳卜止I詞沢IFiteE*hiatr-Pess隔曲站RuWEl治甌b口鶴空2y.4也AIA4、消除圖片背景的影響。ProcessSubtractBackgr

4、ound。在彈出的對話框中，填上50基本就可以了，也可以稍高些，并勾上Lightbackground，點(diǎn)擊0K即可。此時(shí)圖片背景會變白一些。5、設(shè)置定量參數(shù)。AnalyzeSetMeasurements。在彈出的對話框中勾選Area、Meangrayvalue、Min&maxgrayvalue、Integrateddensity。1哥*lFWaiNigrapifiitjc廣rxx-otMWIF*wgflbywu*FIdriiniMcqiMYarfUH|iE；int-Eiil廠Cenhsicfmass|lPed*rrEunangFFhtllplf廠dauaplai廠gLirmlerFrE測MUM

5、ITKdUTU1*Wfw*1廠訴?*P9Ft*r,FLtfrwllE-bwiiiniid廠ia&H廠ImwflYluirifejiMlay廠$UHTtilESUERI廠MHfcXMiidlD1叫Ciumaipjia(D-Pj廠試|Caficl|Hiklp|6、設(shè)置單位。AnalyzeSetScale。在彈出的對話框“Unitoflength”后面填上“pixels”,其他的不用改動(dòng)。Gai勺kinefiiAbhkineighcst-bond-we-stcrri-blcit-dr=292k92pixels-8-0it26K7、把WB圖片轉(zhuǎn)換成亮帶。Edit-Invert。8、選擇菜單欄下的一系列

6、不規(guī)則圓圈，根據(jù)情況選擇一種。然后將圓圈手動(dòng)拉倒第一條帶并盡量將條帶都圈起來。f【E.勺訕11=進(jìn)PileEdriImaMProces&AnalyserPluginsWindowl-Wp9、點(diǎn)擊菜單欄Analyze下拉出現(xiàn)的measurement,即可彈出你選定區(qū)域的灰度統(tǒng)計(jì)值。也可以點(diǎn)擊快捷鍵（英文狀態(tài)下的鍵盤m）。10、手動(dòng)移動(dòng)不規(guī)則圓圈至下一條條帶，重復(fù)8、9步驟，直至所有條帶都被測量。11、當(dāng)測定完所有條帶，選結(jié)果中的“Edit”的“SelectAll”，然后復(fù)制數(shù)據(jù)“IntDen”到Excel表即可進(jìn)行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇FilefSaveas，直接導(dǎo)出ex

7、cel表格。udlln.11飭TLOG.5333H.EM帖.AVA關(guān).機(jī)HE74.tt5；宜皈議43127右3甌廠:&195-珈存4H1.1MME言羽創(chuàng)W盼翼力怙STI-13*4344=T1574-53巧21山必2LF-!r12、在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進(jìn)行歸一化處理。JAc-FGHIJ121234&87Eg日的蛋色醐？1372$777Q13SO012?421P501fi327417F4GAPDH43&43377093153139i4?S507326204022325051L目的生白/GAPOHO.L35(M33.143472G36S99S0.24X24awt

8、GSO.illOStG&5G5210.4035750.1600813、下載安裝，并打開Graphpad軟件。14、在對話框左側(cè)欄目“Newtable&graph”下選擇“Column”。然后再右側(cè)選擇所要作的圖形，以及是否顯示誤差棒等，具體如下圖。15、在彈出的表格中，填上excel中的比值?？贏WijWbjp2.0DurYi!.社|111|*t|THA111kj=rGai勺kine*Aviwlsbli*anaHyiaiIIM專鐘16、然后點(diǎn)擊菜單欄上InsertfNewGraphofExistingData.。也可以在工具欄Sheet中的“New”條目下找到。（其實(shí)這步可以省略）17、在彈出

9、的對話框“CreateNewGraph”中，填寫新圖名稱，選擇分析方法，圖形，以及誤差棒的表示方法，具體如下。（其實(shí)這步可以省略）Mr-WWriilrvt-QfApEFGH1SJifliTWpiH145t7199V.-JiInfp1M1643a畑陽A441DEIEAC50U1Abhkine匸GdLENewGrdpliTjy?i口Ftol佢le匚bedd-sta匸哥ssonlpjAfcsDp*6t455ocifltrdcirves&刪ia鼻目肌陽r心靶H段百羽I(-ntfwjihmmM聞吐z護(hù)曲Uhavsugpitph閾畫匝碰jdHedg-apkCoflunnbdrtuftphrYeilical

10、Gi-d|jhanuluplhcdltfbimwtilmIbdRVCrnzel|g18、此時(shí)，可以在工具欄下左側(cè)的狀態(tài)欄“Graphs”文件夾中找到所建新圖“Date1”。*GraphRadPrism-Project!:DarJILAleEditVitwInsertClSh/?XTXNcwt*FainilyTO丁冊“械Dat1BOInfoQPrcywtinfo1匸ReuhsDatal19、此時(shí)可以對圖形的外觀進(jìn)行修改，增加圖片題目以及XY軸名稱。直接在圖上對應(yīng)位置左鍵點(diǎn)擊修改。WB條帶灰度分衍oa-.工Qd畐a制昱m=20、也可以借助工具欄“Change”中的功能鍵對圖片的柱形圖顏色、寬度、高度、間隔等進(jìn)行調(diào)整。*$恒TM包rq-卩對且口忖口祖詢1曇FSIpEditVamrIfiMirtChiangeAjrsngpWfirdowHetpPrwnHeSheetLindaClipinafd/Change、JUTingeDranWnte祜上*XFxQUL國LJ比A!%口*TFT0(21、然后點(diǎn)擊工具欄“Export”將新建的柱形圖導(dǎo)出。Ow*geOawWntieTextPrnlSendSilIA圖Ta団QH“Awl也Cjstiplii付Z-A-口.TEAaB1ZU簷冷ExportGrjphXFlbCt曲ItHKEnhanced利就虛編WMFPDFPataMocurwnr