分子克隆教學課件

1、分子克隆第1頁，共39頁。（一）基本概念: 克?。–lone) 指的是通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。分子克?。∕olecular Cloning) 是在體外對DNA分子按照既定的目的和方案進行人工重組，將重組分子導入到合適的受體細胞中，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得DNA分子大量復制，并使受體細胞獲得新得遺傳特征的過程。第2頁，共39頁。載體DNA（vector）目的DNA（target fragment）重組DNA（recombinant DNA ）宿主（host）篩選、擴增克隆（clone）分子克隆的路線DNA 重組轉化第3頁，共39頁。分子克隆的基本過程分獲取目的基因

2、和載體接目的基因與載體的連接篩重組DNA的篩選與鑒定轉重組DNA導入宿主細胞第4頁，共39頁。目的基因的獲取-PCR技術: 定義： PCR技術又稱聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction)，是通過模擬體內 DNA 復制的 方式，在體外選擇性地將 DNA 某個特殊區(qū)域擴 增出來的技術。第5頁，共39頁。Heat-stable polymerase is vital to the ease of the processthermus aquaticusTaq DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)1988年Saiki 等從溫泉（Hotspring）中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus a

3、quaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。第6頁，共39頁。 此酶具有以下特點： 耐高溫， 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。 酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應用。 在1989年，Science將PCR中的Taq DNA多聚酶命 名為當年的風云分子(Moleculeoftheyear) 第7頁，共39頁。94變性 50-65退火72延伸2.PCR反應過程：20-40個PCR循環(huán)1個PCR循環(huán)第8頁，共39頁。PCR擴增原理引物延伸延伸55

4、33變性、退火變性、退火第9頁，共39頁。 模板：單鏈或雙鏈DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶 底物：四種脫氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Mg2+： DNA聚合酶的激活劑 3.PCR基本要素第10頁，共39頁。4.PCR反應程序9496 30-3 預變性（使模板DNA充分變性）94 30 變性50-60 30-1 復性（使引物與模板充分退火）72 n(按1擴增1kb計算）延伸 72 3-7 總的延伸（使產物延伸完整）4-10 保存 25-35個循環(huán)第11頁，共39頁。 3.與反轉錄相關的PCR擴增 RT-PCR

5、（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又稱反轉錄PCR, 是以反轉錄的cDNA作模板所進行的PCR， 可對基因的表達和序列多態(tài)性分析。第12頁，共39頁。聚合酶cDNAPCR擴增AAAnAAAAnA逆轉錄酶反轉錄 T T TnTcDNA第一鏈mRNA第13頁，共39頁。第14頁，共39頁。第15頁，共39頁。PCR結果圖第16頁，共39頁。 重組DNA導入宿主細胞的類型轉化：以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程轉染：以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程轉導：以噬菌體作載體構建的重組體導入受體細胞的過程類型第17頁，共39頁。重組DNA的篩選與鑒定P

6、CR篩選重組體原位雜交技術4123重組DNA的篩選與鑒定方法平板篩選（插入失活、藍白篩選） 第18頁，共39頁。第19頁，共39頁。2.分子克隆中常用工具酶：（1）. 使核酸降解的核酸酶類： 核酸內切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶類： DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，逆轉錄酶。 第20頁，共39頁。 是由細菌自己產生的一種能識別雙鏈DNA中的特定序列，并以內切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內切酶。在細菌體內，這種內切酶可以分解外源性的DNA物質，例如病毒等；而細菌本身的DNA同一識別序列中的某些堿基被甲基化所保護。.限制性核酸內切酶(restriction endonuclea

7、se，RE)的定義第21頁，共39頁。限制性內切酶(Restriction Endonuclease)第22頁，共39頁。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA為模板，從結合在模板上的引物出發(fā)，以dNTP為原料，按堿基配對方式，從5-3方向合成新的DNA鏈。TaqDNA聚合酶在7075時具有最佳的生物活性，隨著溫度的降低，酶活性明顯下降。同時此酶缺乏3-5外切酶活性，因而無校正功能。 第23頁，共39頁。催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5磷酸和3羥基間磷酸二酯鍵形成的酶，稱為DNA連接酶(DNA ligase)。DNA連接

8、酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶 .DNA連接酶：第24頁，共39頁。 3.基因克隆常用載體目前用于基因克隆的載體種類繁多，包括在大腸桿菌中使用的質粒、噬菌體載體、酵母菌質粒載體以及動、植物病毒載體等 （二）分子克隆的基本過程第25頁，共39頁。.質粒載體：質粒自身含有復制起始點，與相應的順式調控元件組成一個復制子(replicon)，能利用細菌的酶系統(tǒng)進行獨立的復制及轉錄。質粒具有多種遺傳選擇標記，包括各種抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因等。 第26頁，共39頁。氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因： 此基因編碼內酰胺酶，該酶能水解氨芐青霉

9、素內酰胺環(huán)，使之失效而使細菌產生耐藥。 遺傳選擇標記： 第27頁，共39頁。DNA限制性內切酶DNA連接酶 100l第28頁，共39頁。4.目的基因的分離與制備、人工合成基因、應用聚合酶鏈反應獲取目的基因（二）分子克隆的基本過程第29頁，共39頁。5.目的基因的體外重組 DNA分子的體外重組:是DNA分子之間的連接過程。這是一個DNA連接酶催化的生物化學反應 。（二）分子克隆的基本過程第30頁，共39頁。6.重組子導入宿主細胞 體外重組生成的重組子必須導入到合適的宿主細胞中才能進行復制、擴增和表達。宿主細胞分為兩種：原核細胞和真核細胞。 （二）分子克隆的基本過程第31頁，共39頁。感受態(tài)細胞(

10、competent cell): 系指利用理化的方法人工誘導細菌，使之處于易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)，這時的細胞就稱為感受態(tài)細胞。 第32頁，共39頁。轉化過程：.用冰預冷的CaCl2處理細胞：即用低滲CaCl2溶液在0時處理快速生長的細胞，從而獲得感受態(tài)細胞。.此時細胞膨脹成球型，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面。第33頁，共39頁。（二）DNA進入細胞：.通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收。.然后將細胞接種于含相應抗生素的培養(yǎng)基上，含有重組子的感受態(tài)細菌將形成單菌落。. 挑選單菌落進行相應的篩選及鑒定分析。 第34頁，共39頁。7.陽性重組子的篩選和鑒定 （二）分子克隆的基本過程第35頁，共39頁。 大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入載體的位點在抗藥性基因之外，不導致抗藥性基因的插入失