沉淀法分離生物產(chǎn)品應(yīng)用實(shí)例課件

1、沉淀法分離生物產(chǎn)品 應(yīng)用實(shí)例報(bào)告人：胡 娜制作：楊卓英 李 敏第1頁，共29頁。果膠原洗面鹽乳食品添加劑果膠第2頁，共29頁。一.沉淀概述1.概念及分類2.原理簡要說明二.沉淀應(yīng)用實(shí)例1.沉淀技術(shù)應(yīng)用-多糖2.沉淀技術(shù)應(yīng)用蛋白質(zhì)第3頁，共29頁。一沉淀概述 1沉淀的概念及種類（1）沉淀的概念：沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。 （2）沉淀的種類鹽析等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法高價(jià)金屬離子沉淀法熱沉淀法第4頁，共29頁。（一）鹽析 蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析。原理1.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙

2、電層厚度降低，靜電排斥作用減弱.2.中性鹽比蛋白質(zhì)具更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭奪水分子.鹽析的主要應(yīng)用 鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。 第5頁，共29頁。（二）等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)在pH等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下降的原理進(jìn)行沉淀分級的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。原理 當(dāng)溶液pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，分子表面的凈電荷為零，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面雙電層和水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。等電點(diǎn)沉

3、析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。第6頁，共29頁。（三）有機(jī)溶劑沉淀 向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。原理親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加。水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，導(dǎo)致溶質(zhì)分子脫水凝聚。有機(jī)溶劑沉

4、析的應(yīng)用 非離子型聚合物最早在20世紀(jì)60年代時(shí)被用來沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些細(xì)菌與病毒，近年來廣泛用于核酸和酶的分離純化。第7頁，共29頁。沉淀應(yīng)用實(shí)例1、沉淀技術(shù)應(yīng)用-多糖 沉淀技術(shù)在多糖的提取過程中應(yīng)用較多，如多糖提取的初級階段大多會用到乙醇沉淀或乙醇分級沉淀，也有一些植物膠體性多糖采用鹽析法沉淀有較好的效果。此外，也常采用選擇性沉淀的方法如三氯乙酸去除多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 第8頁，共29頁。(1)果膠的提取 果膠是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的膠體性多糖類物質(zhì)，包括原果膠、水溶性果膠和果膠酸三大類。它是植物體內(nèi)特有的細(xì)胞壁組分，存在于橘子、蘋果、馬鈴薯等植物的葉、皮、莖及果

5、實(shí)中，主要用于果醬、果凍、食品添加劑、食品包裝膜以及生物培養(yǎng)基的制造。 鹽析法提取果膠實(shí)驗(yàn)方法： 15g新鮮仙人掌，小刀切成小顆粒80ml小燒杯，加水10%鹽酸調(diào)pH值至2.1左右超聲波處理，趁熱抽濾 濾液加入一定量鋁鹽飽和溶液 攪拌，加NaoH，調(diào)至一定pH 第9頁，共29頁。 沉析1.5小時(shí)后過濾，洗滌沉淀所得的果膠鋁沉淀用預(yù)先配制好的60%的乙醇與10%的鹽酸混合液（體積比7：1）洗滌，以置換出鋁離子用60%乙醇反復(fù)洗滌沉淀烘干就得產(chǎn)品 也可以用乙醇沉淀法提取，但將乙醇沉淀法與鹽析法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀法所得的果膠量較少，產(chǎn)品性狀和色澤都不好，且乙醇消耗大、濾液收集時(shí)損失大；而用鹽

6、析法產(chǎn)品多，質(zhì)量好，節(jié)約能源，大大降低成本。所以，用鹽析法提取仙人掌中的果膠較傳統(tǒng)的乙醇沉淀法優(yōu)越。第10頁，共29頁。果醬 第11頁，共29頁。果凍 第12頁，共29頁。妙戀果膠原緊致祛皺眼霜 第13頁，共29頁。.美肌一族臉部去角質(zhì)保濕果膠 第14頁，共29頁。（2）莢膜多糖的提取 可采用乙醇、甲醇、丙酮、甲縮醛幾種有機(jī)溶劑單獨(dú)或組合使用對莢膜多糖沉淀提取。實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)甲醇+甲縮醛沉淀的粗提物，無論是得率還是有效成分都是最好的，而80%丙酮與86%乙醇沉淀效果相當(dāng)，由于甲醇+甲縮醛成本很高，同時(shí)考慮到操作和產(chǎn)品安全問題，所以，一般采用86%乙醇沉淀。第15頁，共29頁。.-多糖,天然 草莓

7、保鮮劑口腔生物多糖膜 第16頁，共29頁。 2.沉淀技術(shù)應(yīng)用蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)（酶）的提取在粗分離階段大多要用到沉淀分離的方法，其中鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、多聚物沉淀、選擇性變性沉淀去除雜質(zhì)的方法，應(yīng)用較為廣泛。 （1)等電點(diǎn)法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì) 1.原料的前處理 新鮮鰱魚去頭、尾和內(nèi)臟，漂洗，采肉，用TF一12型攪拌機(jī)將魚肉攪成肉糜。第17頁，共29頁。2.魚肉蛋白質(zhì)酸溶解條件的確定 （1）pH 條件的確定 （2）溶解時(shí)間的確定 （3）固液比的確定 （4）溶解溫度的確定 （5）溶解效果的測定第18頁，共29頁。3.蛋白質(zhì)沉淀?xiàng)l件的確定 利用等電點(diǎn)沉淀技術(shù)，小心調(diào)節(jié)魚肉蛋白溶解液的pH值，當(dāng)pH值達(dá)到

8、等電點(diǎn)時(shí)，魚肉蛋白質(zhì)便沉淀出來。由于魚肉中含有多種蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)各不相同，因此，當(dāng)沉淀物中蛋白質(zhì)含量最高或上清液中蛋白質(zhì)含量最低時(shí)，此時(shí)的pH值便為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀的最適pH值。 取在最適酸溶解條件下的魚肉蛋白溶解液各250 ml，分別加入氫氧化鈉溶液使之調(diào)節(jié)在不同的pH值(變化范圍：pH一39)，在4條件下保持30 min，保證蛋白質(zhì)能充分沉淀出來，然后用低速大容量多管離心機(jī)以4 500 rmin離心15 min，取上清液及魚肉用微量凱氏定氮法測定粗蛋白含量，按下式計(jì)算蛋白溶解率第19頁，共29頁。 蛋白質(zhì)溶解率(% )=魚肉蛋白溶解液的粗蛋白含量魚肉的粗蛋白含量100 用等電點(diǎn)沉淀法提取

9、的魚肉蛋白質(zhì)無腥味，色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高，可達(dá)90%左右，而且生產(chǎn)工藝簡單易操作。可在生產(chǎn)實(shí)際中推廣。低速大容量多管離心機(jī)第20頁，共29頁。第21頁，共29頁。最佳蛋白質(zhì)來源魚肉第22頁，共29頁。（2）棉鈴蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的純化 采用聚乙二醇（PEG)沉淀法，硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化 棉鈴蟲 第23頁，共29頁。.小鼠谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶ELISA試劑盒BBB 第24頁，共29頁。(3）-甘露聚糖酶的純化 采用硫酸銨鹽析法，丙酮沉淀法，聚乙二醇沉淀法對枯草芽孢桿菌K3-14菌株發(fā)酵產(chǎn)生的-甘露聚糖酶進(jìn)行提純 聚乙二醇的純化效果最好，易于酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，但使用的濃度較大，黏度較大，而且

10、該法酶收率不高，不宜用于生產(chǎn)。丙酮易于回收，成本低，因此，工業(yè)上最好采用丙酮沉淀法。第25頁，共29頁。第26頁，共29頁。博特美TM-甘露聚糖酶 博特美-甘露聚糖酶 是由基因工程菌經(jīng)深層液體發(fā)酵而成，活性強(qiáng)、效價(jià)高，達(dá)到國際領(lǐng)先水平，能有效提高豆粕類原料的代謝能，促進(jìn)生長和健康，是新一代的飼用酶制劑。 -甘露聚糖酶（endo-1,4-mannanase）是一種新型的酶制劑，屬于一種半纖維素酶類，它除具有一般非淀粉多糖（NSP）酶類的作用降解NSP，降低腸道粘度，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收外；近來很多研究表明，-甘露聚糖酶還是一種多功能的促生長劑，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)類胰島素生長因子IGF-I的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高瘦