2022年《儀器分析》教案6紫外可見吸收光譜法

1、第九章紫外 -可見吸取光譜法 91 教學建議一、從光譜定性分析和定量分析的依據(jù)和方法入手,介紹紫外 機和無機化合物的紫外-可見吸取光譜特點；-可見吸取光譜原理、有二、在通用光譜分析儀器結構的總框架下,介紹紫外-可見分光光度計結構組成、特點及應用；92 主要概念一、教學要求：（一）、把握紫外 -可見吸取光譜法的基本原理；（二）、把握物質(zhì)分子結構與紫外-可見吸取光譜的關系；（三）、明白紫外 -可見分光光度計結構組成與應用；二、內(nèi)容要點精講 9-1 概 述 利用紫外可見分光光度計測量物質(zhì)對紫外可見光的吸取程度（吸光度） 和紫外可見吸取 光譜來確定物質(zhì)的組成、含量, 估計物質(zhì)結構的分析方法,稱為紫外可

2、見吸取光譜法或紫外 可見分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-VIS）；它具有如下特 點：（1）靈敏度高適于微量組分的測定,一般可測定 以達到 104105 數(shù)量級；10-6g 級的物質(zhì),其摩爾吸取系數(shù)可 2 精確度較高其相對誤差一般在1%5%之內(nèi)；3 方法簡便操作簡潔、分析速度快；4 應用廣泛不僅用于無機化合物的分析,更重要的是用于有機化合物的鑒定及結構分析（鑒定有機化合物中的官能團）；可對同分異構體進行鑒別；此外,仍可用于協(xié)作物的組成和穩(wěn)固常數(shù)的測定；紫外可見吸取光譜法也有肯定的局限性,有些有機化合物在紫外可見光區(qū)沒有吸取譜帶

3、,有的僅有較簡潔而寬敞的吸取光譜,更有個別的紫外可見吸取光譜大體相像；例如,甲苯和乙苯的紫外吸取光譜基本相同；因此, 單依據(jù)紫外可見吸取光譜不能完全打算這些物質(zhì)的分子結構, 只有與紅外吸取光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜等方法協(xié)作起來,得出的結論才會更牢靠； 9-2 紫外可見吸取光譜法的基本原理當一束紫外可見光（波長范疇200760nm）通過一透亮的物質(zhì)時,具有某種能量的光子被吸取, 而另一些能量的光子就不被吸取,光子是否被物質(zhì)所吸取既打算于物質(zhì)的內(nèi)部結構,也打算于光子的能量；當光子的能量等于電子能級的能量差時（即 E 電 = h f ）,就此能量的光子被吸取,并使電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)；物質(zhì)對光的吸

4、取特點,可用吸取曲線來描述； 以波長 為橫坐標, 吸光度 A為縱坐標作圖, 得到的 A- 曲線即為紫外可見吸收光譜（或紫外可見吸取曲線）；它能更清晰地描述物質(zhì)對光的吸取情形（圖 9-1 ）；從圖 9-1 中可以看出： 物質(zhì)在某一波特長對光的吸取最強,稱為最大吸取峰,對應的波長稱為最大吸取波長（ max）；低于高吸取峰的峰稱為次峰；吸取峰旁邊的一個小的曲折稱為肩峰； 曲線中的低谷稱為波谷其所對應的波長稱為最小吸取波長（ min）；在吸取曲線波長最短的一端,吸取強度相當大,但不成峰形的部分,稱為末端吸取；同一物質(zhì)的濃度不同 時,光吸取曲線外形相同,最大吸取波長不變,只是相應的吸光度大小不同；物質(zhì)不

5、同,其分子結構不同,就吸取光譜曲線不同,max不同,所以可依據(jù)吸取光譜曲線對物質(zhì)進行定性鑒定和結構分析；物質(zhì)吸光的定量依據(jù)為朗伯- 比爾定律： A=KcL；說明物質(zhì)對單色光的吸取強度 A 與溶 液的濃度 c 和液層長度 L 的乘積成正比,K 為摩爾吸取系數(shù),其單位為 L mol- 1 cm-1 ,它與入射光的波長、溶液的性質(zhì)以及溫度有關； K 反映吸光物質(zhì)對光的吸取才能,也反映定量測定的靈敏度；K值越大, 說明該物質(zhì)在 某特定條件的吸取才能越強,測定的靈敏度越高；它是描述物質(zhì)紫外可見吸取光譜的主要特 征,也是物質(zhì)定性分析的重要依據(jù)； 9-3 紫外可見吸取光譜與分子結構的關系 一、電子躍遷的類型

6、紫外可見吸取光譜是由于分子中價電子能級躍遷而產(chǎn)生的；見吸取光譜取決于分子中價電子的性質(zhì)；因此,有機化合物的紫外可依據(jù)分子軌道理論,在有機化合物分子中與紫外可見吸取光譜有關的價電子有三種：形成單鍵的 電子, 形成雙鍵的 電子和分子中未成鍵的孤對電子,稱為 n 電子； 當有機化合物吸取了可見光或紫外光,分子中的價電子就要躍遷到激發(fā)態(tài),其躍遷方式主要有四種類型,即 *,n *,n *, *；各種躍遷所需能量大小為： *n *n * *；電子能級間位能的相對大小見圖 9-2 所示；一般未成鍵孤對電子 n 簡潔躍遷到激發(fā)態(tài)；成鍵電子中, 電子較 電子具有較高的能級,而反鍵電子卻相反；故在簡潔分子中的 n

7、 *躍遷需要的能量最小,吸取峰顯現(xiàn)在長波段； 波段；而 * 躍遷需要的能量最大,顯現(xiàn)在遠紫外區(qū)；1. * 躍遷* 躍遷的吸取峰顯現(xiàn)在較短成鍵 電子由基態(tài)躍遷到 *軌道；在有機化合物中,由單鍵構成的化合物,如飽和烴類能產(chǎn)生 *躍遷；引起 * 躍遷所需的能量很大；因此,所產(chǎn)生的吸取峰出現(xiàn)在遠紫外區(qū), 即在近紫外區(qū)、 可見光區(qū)內(nèi)不產(chǎn)生吸取,見吸取光譜分析時的溶劑（如正己烷、正庚烷）；2. n * 躍遷故常采納飽和烴類化合物做紫外可分子中未共用 n 電子躍遷到 * 軌道；凡含有 n 電子的雜原子（如 ON XS 等）的飽和化合物都可發(fā)生 n * 躍遷；此類躍遷比 * 所需能量小, 一般相當于 150-

8、250nm 的紫外光區(qū),但躍遷概率較小,3. * 躍遷 K 值在 102103 L mol-1 cm-1,屬于中等強度吸?。怀涉I 電子由基態(tài)躍遷到 * 軌道；凡含有雙鍵或三鍵的不飽和有機化合物（如 C=C 、CC等）都能產(chǎn)生 * 躍遷；其所需的能量與 n * 躍遷相近,吸取峰在200nm鄰近,屬強吸?。?共軛體系中的 * 躍遷, 吸取峰向長波方向移動,在 200-700nm的紫外可見光區(qū)；n * 躍遷未共用 n 電子躍遷到 *軌道；含有雜原子的雙鍵不飽和有機化合物能產(chǎn)生這種躍遷；如含有 C=O、C=S、N=O、N=N等雜原子的雙鍵化合物；躍遷的能量較小,吸取峰出現(xiàn)在 200-400nm 的紫外

9、光區(qū),屬于弱吸?。籲 *及 * 躍遷都需要有不飽和官能團存在,以供應 軌道；這兩類躍遷在有機化合物中具有特別重要的意義,是紫外可見吸取光譜的主要討論對象,由于躍遷所需的能量使吸取峰進入了便于試驗的光譜區(qū)域（200-1000nm）；二、發(fā)色團、助色團和吸取帶 1. 發(fā)色團含有不飽和鍵, 能吸取紫外、 可見光產(chǎn)生 * 或 n * 躍遷的基團稱為發(fā)色團（或生色團）；例如 C=CC=O、C=N、 N=N、 COOH 等；2. 助色團含有未成鍵n 電子, 本身不產(chǎn)生吸取峰,但與發(fā)色團相連,能使發(fā)色團吸取峰向長波方向移動,吸取強度增強的雜原子基團稱為助色團；例如一 3. 吸取帶NH2、OH、OR、SR、X

10、 等；在紫外可見吸取光譜中,吸取峰的波帶位置稱為吸取帶,通常分以下四種； 1 R 吸取帶這是與雙鍵相連接的雜原子（例如 C=O、C=N、S=O等）上未成鍵電子的孤對電子向 * 反鍵軌道躍遷的結果,可簡潔表示為 n *；其特點是強度較弱,一般KBK、E1 、E2 ,但一般 K和 E 帶常合并成一紫外可見吸取光譜主要取決于分子中價電子的能級躍遷,但分子的內(nèi)部結構和外部環(huán)境都會對紫外可見吸取光譜產(chǎn)生影響；明白影響紫外可見吸取光譜的因素,對解析紫外光譜、鑒定分子結構有特別重要的意義；1. 共軛效應 共軛效應使共軛體系形成大 鍵,結果使各能級間能量差減小,躍遷所需能量減?。灰虼斯曹椥刮〉牟ㄩL向長波

11、方向移動,吸取強度也隨之加強；隨著共軛體系的加長,吸取峰的波長和吸取強度呈規(guī)律地轉(zhuǎn)變；2. 助色效應助色效應使助色團的n 電子與發(fā)色團的電子共軛,結果使吸取峰的波長向長波方向移動,吸取強度隨之加強；3. 超共軛效應這是由于烷基的鍵與共軛體系的 鍵共軛而引起的, 其效應同樣使吸取峰向長波方向移動,吸取強度加強；但超共軛效應的影響遠遠小于共軛效應的影響；4. 溶劑的影響 溶劑的極性強弱能影響紫外可見吸取光譜的吸取峰波長、吸取強度及外形；如轉(zhuǎn)變?nèi)?劑的極性,會使吸取峰波長發(fā)生變化；表 9-1 列出了溶劑對異亞丙基丙酮 CH3COCH=CCH32 n *躍遷所產(chǎn)生的吸取峰 紫外吸取光譜的影響；從表 9

12、-1 可以看出,溶劑極性越大,由 向短波方向移動（稱為短移或紫移）,而 *躍遷吸取峰向長波方向移動（稱為長移或 紅移）；表 9-1 異亞丙基丙酮的溶劑效應溶己烷正m 氯仿m 甲醇m 水移動向 長 波劑nm 230238n237n243n *nnm 329m 315nm 309nm 305n移動向 短 波 *因此,測定紫外可見光譜時應注明所使用的溶劑,內(nèi)無明顯吸取；四、各類有機化合物的紫外可見特點吸取光譜 1. 飽和有機化合物所選用的溶劑應在樣品的吸取光譜區(qū)飽和碳氫化合物只能產(chǎn)生 *躍遷,所需能量較高,只有遠紫外光的能量才行,在所討論的近紫外、可見光區(qū)不產(chǎn)生吸取,因此常被用于做紫外可見光譜分析時

13、的溶劑；2. 不飽和有機化合物（1）含有孤立雙鍵的化合物烯烴能產(chǎn)生 * 躍遷,吸取峰位于遠紫外區(qū)；當烯烴雙鍵上的碳原子被雜原子取代時（如 C=O、C=S等基團）,可產(chǎn)生 n *、 *及 n *躍遷；（2）含有共軛雙鍵的化合物共軛二烯、多烯烴及共軛烯酮類化合物中由于存在共軛效應,使 * 躍遷所需能量減小,從而使其吸取波長和吸取程度隨著共軛體系的增加而增加； 其最大吸取波長除可以用紫外可見分光光度計測量外,仍可利用體會公式推算,有時將運算結果與試驗結果相比較,可確定待測物質(zhì)的結構；, 不飽和醛酮等化合物的 Wood ward-Fieser 規(guī)章 max 可依據(jù)進行運算；鏈狀及環(huán)狀共軛多烯的 max

14、 運算時, 第一從母體得到一個最大吸取的基本值,然后對連接在母體 電子體系上的不同取代基以及其它結構因素加以修正；表 9-2 共軛多烯類化合物最大吸取波長運算法* （以己烷為溶劑）母體基本值/ nm max 舉例說明鏈狀共軛二烯217 單環(huán)共軛二烯異環(huán)共軛二烯217 同環(huán)共軛二烯214 253 增加值取代延長一個共軛雙鍵+30 增加一個烷基或環(huán)基+5 +5 增加一個環(huán)外雙鍵助色團取代OCOR酯基 +0 Cl 或 Br +5 OR烷氧基 +6 NR2 +60 SR烷硫基 +30 *同環(huán)二烯與異環(huán)二烯同時并存時,按同環(huán)二烯運算； Fieser-Kuhn 規(guī)章假如一個多烯分子中含有四個以上的共軛雙鍵

15、,就它們在己烷中的吸取光譜的 max值和 max值分別由 Fieser-Kuhn 規(guī)章運算 max l14 十 5M十 n48.0 max1.74 104 n一 1.7n 一 16.5R1 一 10R 2 式中, M是雙鍵體系上烷基取代的數(shù)目; n 是共軛雙鍵的數(shù)目,R1是具有橋環(huán)雙鍵的環(huán)數(shù)； R 2 是具有環(huán)外雙鍵的環(huán)數(shù)； Scott 規(guī)章CCCCCO , - 不飽和羰基化合物（醛酮）的 * 躍遷吸取波長 max 運算法如表9-3 所示；表 9- 3 ,- 不飽和醛酮最大吸取波長運算法（以乙醇為溶劑）母體基本值 * 躍遷 max / nm鏈狀 , - 不飽和醛 207 直鏈及六元環(huán) ,- 不

16、飽和酮 215 五元環(huán) , - 不飽和酮 202 , - 不飽和酸酯 193 增加值同環(huán)共軛二烯 +39 增加一個共軛雙鍵 +30 增加一個環(huán)外雙鍵、 五元及七元環(huán)內(nèi)雙鍵烯基上取代+5 位位位烷基或環(huán)殘基取代位烷氧基取代 OR10 12 18 18 羥基取代 OH35 30 17 31 ?；〈?OCOR35 30 50 50 鹵素 Cl 6 6 6 6 鹵素 Br 15 12 12 12 含硫基團取代 SR25 30 25 25 氨基取代 NRR 80 95 3. 芳香族化合物由前所述可知,E帶和 B帶是芳香族化合物的特點吸取,它們均由 *表 9-4 苯及其衍生物的吸取特點躍遷產(chǎn)生,當苯環(huán)上

17、的取代基不同時,其E2 帶和 B 帶的吸取峰也隨之變化,故可由此來鑒定各種取代基；苯及其衍生物的吸取特點見表 9-4 ； 9-4 紫外可見分光光度計用于測量和記錄待測物質(zhì)對紫外光、可見光的吸光度及紫外-可見吸取光譜,并進行定性定量以及結構分析的儀器,稱為紫外可見吸取光譜儀或紫外可見分光光度計；一、儀器的基本構造紫外可見分光光度計,其波長范疇2001000nm ,構造原理與可見光分光光度計（如721 型分光光度計）相像,都是由光源、單色器、吸取池、檢測器和顯示器五大部件構成,見圖 9-4 ；1. 光源光源是供應入射光的裝置；要求在所需的光譜區(qū)域內(nèi),發(fā)射連續(xù)的具有足夠強度和穩(wěn)固的紫外及可見光,并且

18、輻射強度隨波長的變化盡可能小,使用壽命長；在可見區(qū)常用的光源為鎢燈,可用的波長范疇3501000nm；在紫外區(qū)常用的光源為氫燈或氘燈,它們發(fā)射的連續(xù)光波長范疇為 180360nm；其中氘燈的輻射強度大,穩(wěn)固性好,壽命也長； 2. 單色器單色器一般由狹縫、色散元單色器是將光源輻射的復合光分成單色光的光學裝置；件及透鏡系統(tǒng)組成；最常用的色散元件是棱鏡和光柵；棱鏡通常用玻璃、石英等制成；玻璃適用于可見光區(qū),石英材料適用于紫外光區(qū)； 3. 吸取池吸取池材料必需能夠透過所測光譜范疇的光,一般可見光區(qū)用于盛裝試液的裝置；使用玻璃吸取池,紫外光區(qū)使用石英吸取池； 4. 檢測器要求靈敏度高, 響應時間短, 噪

19、聲水平低且有良是將光信號轉(zhuǎn)變成電信號的裝置；好的穩(wěn)固性；常用的檢測器有硒光電池、光電管、光電倍增管和光電二極管陣列檢測器；硒光電池構造簡潔,價格廉價,使用便利,但長期曝光易“ 疲憊” ,靈敏度也不高；光電管靈敏度比硒光電池高,它能將所產(chǎn)生的光電流放大,可用來測量很弱的光；常用的光電管有藍敏和紅敏光電管兩種；前者是在鎳陽極表面沉積銻和銫,適用波長范疇 210625nm ；后者是在陰極表面沉積銀和氧化銫,適用范疇 6251000nm；光電倍增管比一般光電管更靈敏,是目前高中檔分光光度計中常用的一種檢測器（其工作原理見第八章中“ 光電轉(zhuǎn)換器” ）；光電二 極管陣列檢測器（photo-diode ar

20、ray detector）是紫外可見光度檢測器的一個重要進展； 這類檢測器用光電二極管陣列作檢測元件,陣列由數(shù)百個光電二極管組成,各自測量一窄段即幾十微米的光譜；通過單色器的光含有全部的吸取信息,在陣列上同時被檢測,并用電子學方法及運算機技術對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù),由于掃描速度特別快,可以得到三維（A , , t ）光譜圖；5. 顯示器顯示器是將檢測器輸出的信號放大并顯示出來的裝置；常用的裝置有電表指示、圖表指示及數(shù)字顯示等；二、儀器的類型紫外可見分光光度計主要有單光束分光光度計、雙光束分光光度計、雙波長分光光度計以及光電二極管陣列分光光度計；1. 單光束分光光度計單光束分光光度計光路示

21、意圖如前面的圖9-4 所示,一束經(jīng)過單色器的光,輪番通過參比溶液和樣品溶液來進行測定；這種分光光度計結構簡潔,價格廉價,主要用于定量分析；但這種儀器操作麻煩,如在不同的波長范疇內(nèi)使用不同的光源、不同的吸取池, 且每換一次波長,都要用參比溶液校正等等,也不適于作定性分析；國產(chǎn)的 度計都是單光束分光光度計；2. 雙光束分光光度計751 型和 WFD-8A型分光光雙光束分光光度計的光路設計基本上與單光束相像,如圖 9-5 所示, 經(jīng)過單色器的光被斬光器一分為二,一束通過參比溶液,另一束通過樣品溶液,然后由檢測系統(tǒng)測量即可得到樣品溶液的吸光度；由于采納雙光路方式,兩光束同時分別通過參照池和測量池,使操

22、作簡潔,同時也消除了因光源強度變化而帶來的誤差；國產(chǎn)的雙光束分光光度計有710 型和 730 型；圖9-6是一種雙光束記錄式分光光度計光路系統(tǒng)圖；3. 雙波長分光光度計單光束和雙光束分光光度計,就測量波長而言, 都是單波長的； 雙波長分光光度計是用兩種不同波長（ 1 和 2）的單色光交替照耀樣品溶液（不需使用參比溶液）；經(jīng)光電倍增管和電子掌握系統(tǒng),測得的是樣品溶液在兩種波長 1 和 2 處的吸光度之差 A, A= A 1A 2,只要 1 和 2 挑選適當, A 就是扣除了背景吸取的吸光度；儀器原理方框圖如圖 9-7 所示；雙波長分光光度計不僅能測定高濃度試樣、多組分混合試樣,并能測定混濁試樣（

23、見 9 -5中“ 用雙波長分光光度法進行定量分析” ）；雙波長分光光度計在測定相互干擾的混合試樣時,不僅操作簡潔,而且精確度高；4. 光電二極管陣列分光光度計一種利用光電二極管陣列作多道檢測器,光度計,具有快速掃描吸取光譜的特點；由微型電子運算機掌握的單光束紫外可見分光從光源發(fā)射的復合光,通過樣品吸取池后經(jīng)全息光柵色散,通過一個可移動的反射鏡使光束通過幾個吸取池,色散后的單色光由光電二極管陣列中的光電二極管接受,光電二極管與電容耦合, 當光電二極管受光照耀時,電容器就放電, 電容器的帶電量與照耀到光電二極管上的總光量成正比；由于單色器的譜帶寬度接近于光電二極管的間距,每個譜帶寬度的光信號由一個

24、光電二極管接受,一個光電二極管陣列可容納 400 個光電二極管,可掩蓋 200800nm波長范疇,辨論率為 12nm,其全部波長可同時被檢測而且響應快,在極短時間內(nèi) （2s）給出整個光譜的全部信息； 9-5 紫外可見吸取光譜法的應用一、定性分析以紫外可見吸取光譜進行定性分析時,通常是依據(jù)吸取光譜的外形,吸取峰的數(shù)目以及最大吸取波長的位置和相應的摩爾吸取系數(shù)進行定性鑒定；一般采納比較光譜法,即在相同的測定條件下, 比較待測物與已知標準物的吸取光譜曲線,假如它們的吸取光譜曲線完全等同（ max及相應的 K 均相同）,就可以認為是同一物質(zhì)；進行這種對比法時,也可借助前人匯編的標準譜圖進行比較；二、結

25、構分析 1. 依據(jù)化合物的紫外可見吸取光譜估計化合物所含的官能團例如, 某化合物在紫外可見光區(qū)無吸取峰,就它可能不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系,它可能是飽和有機化合物；假如在 200250nm有強吸取峰,可能是含有兩個雙鍵的共軛體系；在260350nm有強吸取峰,就至少有 35 個共軛發(fā)色團和助色團；假如在 270350nm區(qū)域內(nèi)有很弱的吸取峰,并且無其它強吸取峰時,就化合物含有帶 n 電子的未共軛的發(fā)色團（C=O,NO2,N=N等） ,弱峰由 n * 躍遷引起的；如在260nm鄰近有中吸取且有一定的精細結構,就可能有芳香環(huán)結構（在 230270nm的精細結構是芳香環(huán)的特點吸?。?2. 利用紫外可見

26、吸取光譜來判別有機化合物的同分異構體例如,乙酰乙酸乙酯的互變異構體：OOOHO在 245nm處有強CH 3CCH 2COC2H5CH 3CCHCOC 2 H 5酮式烯醇式酮式?jīng)]有共軛雙鍵,在 206nm處有中吸?。?而烯醇式存在共軛雙鍵,吸取（ K =18000 L mol - 1 cm-1 ）；因此依據(jù)它們的吸取光譜可判定存在與否；一般在極性溶劑中以酮式為主；非極性溶劑中以烯醇式為主；又如, 1,2- 二苯乙烯具有順式和反式兩種異構體：由于順反異構體的 max 及 K 不同,可用紫外可見光譜判定順式或反式構型；反式HHH max=280nm K=14000 CCCCH順式 max=295nm

27、 K=27000 L mol- 1 cm- 1 L mol - 1 cm-1 三、定量分析紫外可見分光光度法用于定量分析的依據(jù)是朗伯- 比爾定律,即物質(zhì)在肯定波特長的吸光度與它的濃度呈線性關系；故通過測定溶液對肯定波長入射光的吸光度,便可求得溶液的濃度和含量； 紫外可見分光光度法不僅用于測定微量組分,混合物的測定；1. 單組分物質(zhì)的定量分析而且用于常量組分和多組分（1）比較法在相同條件下配制樣品溶液和標準溶液（與待測組分的濃度近似）,在相同的試驗條件和最大波長 max 處分別測得吸光度為 Ax 和 As,然后進行比較,求出樣品溶液中待測組分的濃度 即 cx = cs Ax/As ；（2）標準曲

28、線法第一配制一系列已知濃度的標準溶液,在 max處分別測得標準溶液的吸光度,然后,以吸光度為縱坐標,標準溶液的濃度為橫坐標作圖,得 A-c 的校正曲線圖（抱負的曲線應為通過原點的直線）上 求得相應的試液的濃度；2. 多組分物質(zhì)的定量分析；在完全相同的條件下測出試液的吸光度,并從曲線依據(jù)吸光度加和性原理,對于兩種或兩種以上吸光組分的混合物的定量分析,可不需分離而直接測定；依據(jù)吸取峰的相互干擾情形,分為以下三種,如圖 9-8 所示；1 ）吸取光譜不重疊如圖 9-8 （a）所示,混合物中組分 a,b 的吸取峰相互不干擾,即在 1 處,組分 b 處,無吸取,而在 2 處,組分 a 無吸取,因此,可按單

29、組分的測定方法分別在 1 和 2 處測得組分 a 和 b 的濃度；2 吸取光譜單向重疊如圖 9-8b 所示,在 1 處測定組分 a,組分 b 有干擾,在 2b處測定組分 b,組分 a 無干擾,因此可先在 2 處測定組分 b 的吸光度 A 2；b b bA 2 K c 2 Lb式中 K 2 為組分 b 在 2 處的摩爾吸取系數(shù),可由組分 b 的標準溶液求得,故可由上a b式求得組分 b 的濃度；然后再在 1 處測定組分 a 和組分 b 的吸光度 A 1；a b a b a a b bA 1 A 1 A 1 K c 1 L K c 1 La b式中,A 、A 分別為組分 a、 b 在 1 處的摩爾

30、吸取系數(shù),它們可由各自的標準溶液求得 , 從而可由上式求出組分 a 的濃度；3 吸取光譜雙向重疊如圖 9-8 c 所示,組分 a、 b 的吸取光譜相互重疊,同樣有吸a b a b光度加和性原就在 1 和 2 處分別測得總的吸光度 A 1、A 2；a b a b a a b bA 1 A 1 A 1 K c 1 L K c 1 La b a b a a b bA 2 A 2 A 2 K c 2 L K c 2 La a b b式中,K 1、K 2、K 1、K 2 分別為組分 a、b 在 1、 2 處的摩爾吸取系數(shù),它們a b同樣可由各自的標準溶液求得,因此,通過解方程求得組分 a 和 b 的濃度

31、 c 和 c ；明顯,有 n 個組分的混合物也可用此法測定,聯(lián)立 n 個方程組便可求得各自組分的含量,但隨著組分的增多,試驗結果的誤差也會增大,精確度降低；4 用雙波長分光光度法進行定量分析對于吸取光譜相互重疊的多組分混合物,除用上述解聯(lián)立方程的方法測定外,仍可用雙波長法測定,且能提高測定靈敏度和精確度；在測定組分a 和 b 的混合樣品時, 一般采納作圖法確定參比波長和測定波長,如圖 9-9 ,選組分 a 的最大吸取波長 1 為測定波長, 而參比波長的挑選,應考慮能排除干擾物質(zhì)的吸收,即使組分b 在 1 處的吸光度等于它在 2 處的吸光度,即b A =b A 2,依據(jù)吸光度加和性原就,混合物在

32、 1 和 2 處的吸光度分別為a b A 1a A 1b A 1a b A 2a A 2b A 2a b a b a b a b由雙波長分光光度計測得 A A 1 A 2 A 1 A 1 A 2 A 2b b a a a a a a由于 A 1 A 2 所以 A A 1 A 2 K c 1 L K c 2 Lc aa Aa K 1 K 2 La aK 1、K 2 分別為組分 a 在 1 和 2 處的摩爾吸取系數(shù), 可由組分 a 的標準溶液在 1和 2 處測得的吸光度求得,由上式求得組分 a 的濃度；同理,也可以測得組分 b 的濃度；雙波長法仍可用于測定混濁樣品、吸光度相差很小而干擾又多的樣品及

33、顏色較深的樣品,測定的精確度和靈敏度都較高；四、示差分光光度法（量程擴展技術）常規(guī)的分光光度法是采納空白溶液作參比的,對于高含量物質(zhì)的測定,相對誤差較大；示差分光光度法是以與試液濃度接近的標準溶液作參比,就由試驗測得的吸光度為AA sA xK cscxLKcL按所挑選的測量條件不同,示差法可分以下兩種；單標準示差分光光度法1 高濃度試液法第一用純?nèi)軇┱{(diào)劑儀器 T=0；然后用一個比試液濃度 cx 稍低的參比溶液 cs 調(diào)劑儀器 T=100%,再測定待測物質(zhì)的透射比或吸光度,如圖 9-10a 所示；假如將標準溶液的透射比由 T=10%擴展到 T=100%,儀器的透射比相當于擴展了 10 倍,就待測

34、物質(zhì)的透射比由 6%擴展到 60%,使吸光度落入了讀數(shù)誤差較小的范疇,提高了測定準確度；2 低濃度試液法 和高濃度試液的測定不同,低濃度是采納參比調(diào)零示差分光光度法；標準溶液的濃度 cs 比 cx 稍大,先用 cs 調(diào)劑儀器 T=0,用純?nèi)軇┱{(diào)劑 T=100%,然后測定待測物質(zhì)的透射比和吸光度,如圖 9-10b 所示；標尺擴展的結果將原先 T=90%100%之間的一段變?yōu)?T=0100%,透射比擴大了 10 倍,將待測物質(zhì)的透射比由 95%變?yōu)?50%, 同樣吸光度落在了抱負區(qū),此法適用于痕量物質(zhì)的測定；2. 雙標準示差分光光度法這種方法采納兩個標準溶液進行量程擴展,一個標準溶液的濃度 cs1

35、 比試液的濃度稍大,另一個標準溶液的濃度 cs2 比試液的濃度稍低；測定時,用 cs1 調(diào)劑儀器 T=0,用 cs2調(diào)劑 T=100%,試液的透射比或吸光度總是處于兩個標準溶液之間；此法適用于任何濃度區(qū)域差別很小的試液的測定,如圖 9-10 （c）所示；五、動力學分光光度法利用反應速率與反應物、產(chǎn)物、 催化劑濃度間的定量關系,通過測量吸光度對待測組分進行定量分析的方法,稱為動力學分光光度法；下面以催化顯色吸光光度法為例介紹其基本原理及測定方法；假設在催化劑 M的作用下,加速以下顯色反應：a A + b B g G + h H如 G為有色化合物,并以G作為指示物質(zhì),考慮到速率方程式上的指數(shù)與化學

36、方程式的系數(shù)不肯定相同,G的顯色（反應）速率可表示如下： 9-1 dc G k cmAcnBc 催dt假如測定的是反應的起始速率,A、B 的濃度較大,反應消耗的A 和 B 可忽視不計,就c A 和 c B 可視為常數(shù)；dc G k c 催 9-2 dt由于c催變化很小,也可視為常數(shù),上式積分得：c G k c t 催 9-3 將上式代入朗伯比爾定律：0 0 A k c G L k k c t kc t 催 9-4 上式說明,催化劑濃度愈大,催化顯色反應時間愈長,就指示物質(zhì) G的吸光度值愈大,這就是動力學分光光度法的基本關系式；催化顯色吸光光度法通常可采納固定時間法、固定吸光度（濃度）法和斜率法

37、三種定量法；固定時間法是依據(jù)反應溶液混合一固定時間后的吸光度來測定催化劑的含量；A k c催 9-5 以不同濃度的催化劑溶液,測得響應的反應體系的A 值,作出 Ac 標準曲線,然后在相同條件和相同顯色時間下測得試液的吸光度,即可從標準曲線上求得試液中催化劑（M）的濃度；固定吸光度法是將反應溶液混合后,由吸光度上升至一固定數(shù)值所需時間來測定催化劑的含量；這種方法實際上是固定濃度法,即當指示物質(zhì)在定容液中的濃度達到一固定值時,其吸光度必定為肯定值,此時式（9-3 ）中的 c G 為一常數(shù)；c 催k2/t1 同樣可以作出 c 催 t 工作曲線,由試樣體系中的 t 值求出催化劑（M）的含量；斜率法是依

38、據(jù)吸光度 （A）隨反應時間的變化速率來測定；依據(jù)式 9-4 ,A kc t 催 ,在不同的c催下測得A t 曲線分別求出其斜率值（kc催 ）作出 kc 催 c 催 工作曲線,在相同條件下測得試液的斜率值,就能很快由工作曲線求出待測物 M 的濃度；此法利用了一系 列的試驗數(shù)據(jù),精確度較高,缺點是比其它方法麻煩；動力學分光光度法具有靈敏度高,挑選性好, 應用范疇廣等特點,特別是酶催化動力學 已廣泛用于生化、環(huán)境愛護、 食品衛(wèi) 分光光度法具有快速簡便以及更好的特效性和精確度；生、醫(yī)藥及臨床檢驗等方面；六、紫外可見吸取光譜法在農(nóng)林水科學中的應用 紫外可見吸取光譜分析法在農(nóng)、林、水、牧等科學中應用廣泛,

39、用途較多；在提高品種 的質(zhì)量和產(chǎn)量方面起著重要的作用；它可以測定樣品中的賴氨酸、色氨酸、蛋白質(zhì)、丹寧、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、葉綠素、農(nóng)藥等很多有機物,也可以測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、全 磷、速效磷、 K、Fe、Ca、Mg、Si 、S 以及 B、Mo、Cu、Zn、Co、 Cr、Al 、Hg、As、Mn等數(shù) 十種元素和很多無機物,涉及的測定對象有土壤、肥料、農(nóng)藥、植物體、水、種子、食品、果蔬、飼料、大氣、粉塵等；在土壤和植物分析中的應用農(nóng)業(yè)和林業(yè)上的一些有重要意義的元素 如 N、P、K、Ca、Mg、S、Si ）以及一些微量元素（ Fe、B、 Mn、Zn、Cu 等）都可用此法進行定量分析； 1 氮利用

40、靛酚藍法測定銨態(tài)氮：NH4+在強堿性介質(zhì)中與次氯酸鹽和苯酚反應生成 水 溶 性 的 靛 酚 藍 （ max=625nm, K=4.3 103L mol - 1 cm-1 ）； 利 用 酚 二 磺 酸 法（ max=410nm, K=9.4 103L mol - 1 cm-1 ）測定硝態(tài)氮； 利用偶氮染料法測定亞硝酸鹽；與 4- 氨基苯磺酸反應生成重氮鹽,再與1- 奈胺偶聯(lián)生成一種偶氮染料（max=520nm,K=4.0 104L mol -1 cm-1 ）；（2）磷利用鉬銻抗法,以形成“ 鉬銻藍”（ max=882nm）進行測定；近年來,利用在 聚 乙 烯 醇 存 在 下 , 磷 銻 鉬 酸 與 結 晶 紫 形 成 可 溶 性 的 離 子 締 合 物（ max=55