補(bǔ)益營衛(wèi)方藥對(duì)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)量及增殖周期的影響

1、補(bǔ)益營衛(wèi)方藥對(duì)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)量及增殖周期的影響何多誼基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：30960479），寧夏醫(yī)科大學(xué)特殊人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（T2007XT200711）作者簡介：何多誼（1982），男，湖南人，在讀碩士研究生，從事中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究。E-mail： HYPERLINK mailto:842829901 842829901通訊作者：周小平（1975），男（回族），寧夏人，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：zhxp1999,周小平1,劉韜1,徐武清1 （寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）摘要:目的 觀察經(jīng)補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清刺激后，衰老人皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)量和增殖周

2、期的變化規(guī)律。方法 體外培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細(xì)胞，當(dāng)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老時(shí)，加入不同濃度的藥物血清配制成的細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法連續(xù)觀察細(xì)胞數(shù)量的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞增殖周期。結(jié)果 補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清高、中、低劑量組中，細(xì)胞數(shù)量和S期細(xì)胞比例均增高，且均高于對(duì)照組，但以高劑量組細(xì)胞數(shù)量和S期細(xì)胞增高比例最明顯。結(jié)論 補(bǔ)益營衛(wèi)方藥促進(jìn)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞增殖,且增殖程度隨著藥物血清濃度的增高而相應(yīng)增高。關(guān)鍵詞:營衛(wèi)；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期Influence of the recipe of supplementing Ying-wei on th

3、e proliferation and cell cycle of the aging human skin fibroblastsHE Duo-yi1, ZHOU Xiao-ping1, LIU Tao1,XU Wu-qing1(Chinese Medicine College of Ningxia Med. Univ. , YinCHuan 750004)Abstract：Objective To observe the influence of the drug serum of supplementing Ying-wei on the proliferation and cell c

4、ycle of the aging human skin fibroblasts Methods normal human skin fibroblasts are cultured in vitro, When the normal human skin fibroblasts are decrepit,we add cell culture medium which is preparated by the drug serum with different concentrations to cultured the aging human skin fibroblasts, to ob

5、serve continuously the cellschanges in the number through cell counting, we observe the cycle of cell proliferation by flow cytometry. Results Among supplementing Ying-wei drug serum with different levels of high, medium and low dose groups, the amount and the percentage of S phase cells in cell cyc

6、le of the aging human skin fibroblasts are increased significantly, and also higher than that of control group, but the high dose group are increased the most obvious. Conclusion The recipe of supplementing Ying-wei can promote the proliferation of the aging skin fibroblast, and which is increased w

7、ith the increasing of drug serum concentrations of the recipe.Key words: Ying-wei; fibroblasts; cell proliferation; cell cycle 營衛(wèi)先解釋何為營衛(wèi)具有“熏膚、充身、澤毛、溫分肉、充皮膚、肥腠理、司開合”的作用，與皮膚生理病理有十分密切的關(guān)系。營衛(wèi)的盛衰與皮膚衰老有密切聯(lián)系1。皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚的重要組成細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)擬通過補(bǔ)益營衛(wèi)觀察其對(duì)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞周期的影響，為補(bǔ)益營衛(wèi)延緩皮膚衰老提供實(shí)驗(yàn)支持。1 材料 1.1 細(xì)胞株來源人皮膚成纖維細(xì)胞株（）：來源

8、于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫，昆明細(xì)胞庫（KCB）編號(hào)：KCB 200505S。1.2 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國）；FBS（Hyclone,北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；胰蛋白酶（Gibco公司,美國）；DMSO（Sigma公司，美國）；青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；碘化丙啶(PI)（Sigma公司,美國）；流式細(xì)胞儀(BD公司,美國)；CO2孵箱(XX-50-型,沈陽偉明醫(yī)療設(shè)備廠)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。1. 藥物補(bǔ)益營衛(wèi)方藥由人參5g、生黃芪15g和炙甘草7g組成。中藥購自寧夏醫(yī)科大學(xué)

9、中醫(yī)門診部，水煎兩次，濃縮至終濃度為4g/ml，置4冰箱冷藏備用。2 方法2.1 含藥血清制備雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體重30050g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證編號(hào)：scxk(京)2006-0009。動(dòng)物隨機(jī)分為補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組、中劑量組、高劑量組組，每組20只。各給藥組依次按照1.5gKg全文改成gkg-1、3gKg、6gKg灌胃，每日一次，連續(xù)一周，第8天末次給藥1小時(shí)全文改成h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌操作進(jìn)行心臟采血，室溫靜置2小時(shí)，2500rpm離心15分鐘min，取出血清，超凈臺(tái)無菌過濾，56滅活30分鐘，-80冰箱中保存?zhèn)溆?。用時(shí)以DMEM培養(yǎng)基將

10、血清稀釋為10的培養(yǎng)液。2.2 人皮膚二倍體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及分組人皮膚二倍體成纖維細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100/ml改成umL-1青霉素，100u/ml鏈霉素，200g/ml L谷氨酰胺，37，5%CO2恒溫培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)2,3，HF細(xì)胞41代以后成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變明顯，46代后的細(xì)胞老化明顯，以此為依據(jù)，本研究的細(xì)胞分組如下：年輕對(duì)照組：取生長狀態(tài)良好的10代細(xì)胞，加10胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。老齡對(duì)照組：取生長狀態(tài)良好的40代細(xì)胞，加10胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組：取生長狀態(tài)良好的40代細(xì)胞，加10補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組大鼠血清培養(yǎng)。補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組：取生長狀態(tài)良好的

11、40代細(xì)胞，加10補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組大鼠血清培養(yǎng)。補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組：取生長狀態(tài)良好的40代細(xì)胞，加10補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組大鼠血清培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)10代（何謂一代，需要幾天，十代共需幾天）。2.3 繪制細(xì)胞生長曲線取對(duì)數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5104/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清（高、中、低劑量組）配制成的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。每天每組取3孔細(xì)胞，用細(xì)胞記數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。細(xì)胞培養(yǎng)三天后，給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換相應(yīng)的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。連續(xù)記數(shù)8天，(是8X3=24天嗎？)以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞增殖生長曲線。（

12、生長曲線的繪制是十代以后還是在十代中間檢測？）2.4 成纖維細(xì)胞增殖周期的檢測4 如果采用的流式細(xì)胞儀，操作過程、成纖維細(xì)胞的圖片及性別周期的流式圖片不可省略。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：進(jìn)行單因素方差分析。表正文中應(yīng)有相應(yīng)處指出見表1的描述1 五組成纖維細(xì)胞增殖周期百分比的變化（n=3 s %）組別SG1G2年輕對(duì)照組老齡對(duì)照組補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組4.630.313.580.358.700.226.070.114.930.1091.970.2294.180.4389.400.2592.840.2791.880.153.401.282.240.701.900.051.090

13、.153.190.18P0.05 vs 年輕對(duì)照組、老齡對(duì)照組3 結(jié)果3.1 補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清對(duì)成纖維細(xì)胞生長曲線的影響(圖1)圖1橫標(biāo)目的數(shù)字和標(biāo)識(shí)點(diǎn)不對(duì)應(yīng)（在中間）？ 各組成纖維細(xì)胞生長曲線3.2 補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清對(duì)成纖維細(xì)胞增殖周期的影響在本實(shí)驗(yàn)中，衰老人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清配制成的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后，S期細(xì)胞數(shù)逐漸增多,補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清刺激濃度和S期細(xì)胞比例之間呈現(xiàn)明顯的量效依賴關(guān)系,與兩個(gè)對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，即隨著補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清濃度的增高，S期細(xì)胞比例均隨之增高，說明補(bǔ)益營衛(wèi)方藥促進(jìn)衰老皮膚成纖維細(xì)胞增殖,且增殖程度隨著補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清濃度的增高而相應(yīng)

14、增高。4 討論 中醫(yī)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)營衛(wèi)與皮膚及皮膚的生理及病理存在十分密切的關(guān)系。營衛(wèi)不足是導(dǎo)致皮膚衰老的重要原因?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為衰老是遺傳、環(huán)境、疾病等多因素協(xié)同作用，發(fā)生在分子、細(xì)胞和整個(gè)機(jī)體的一個(gè)復(fù)雜進(jìn)行性不可逆的過程，可引起生理功能相應(yīng)減弱、適應(yīng)能力和抵抗力下降等綜合表現(xiàn)。普遍認(rèn)為整體的衰老也會(huì)表現(xiàn)在細(xì)胞水平上。體外細(xì)胞模型不僅可以重現(xiàn)生物衰老過程，而且可以避免整體研究的諸多不便和干擾因素，是目前衰老研究的重要模型。正常人二倍體細(xì)胞經(jīng)歷一定次數(shù)的細(xì)胞分裂后，最終進(jìn)入非增殖狀態(tài)，稱之為細(xì)胞衰老。補(bǔ)各個(gè)觀點(diǎn)的文獻(xiàn)依據(jù)前期抗皮膚衰老實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)益營衛(wèi)方藥可提高血清與皮膚中的超氧化物歧化酶（S

15、OD）水平，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量；保護(hù)紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶活性5；提高皮膚羥脯氨酸水平6，改善衰老皮膚形態(tài)學(xué)變化。 每一細(xì)胞增殖過程都要經(jīng)過一個(gè)周期進(jìn)行，包括一個(gè)間期和一個(gè)M期，這個(gè)生活周期即成為細(xì)胞周期。成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期可分為G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。衰老時(shí)，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯的間隙期阻滯，間隙期細(xì)胞的比例隨時(shí)間逐漸提高7。處于生長阻滯期的細(xì)胞有兩條發(fā)展途徑：如果細(xì)胞通過損傷修復(fù)，則可以進(jìn)入下一個(gè)周期；如果細(xì)胞損傷不能修復(fù)，則喪失進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期的能力，發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死8。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

16、是補(bǔ)益營衛(wèi)方藥促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖，說明補(bǔ)益營衛(wèi)方藥可以使衰老的成纖維細(xì)胞通過損傷修復(fù)，進(jìn)入下一個(gè)周期。綜上所述,補(bǔ)益營衛(wèi)可以促進(jìn)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞的生長，補(bǔ)益營衛(wèi)促進(jìn)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖,補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清濃度和S期細(xì)胞增殖比例之間呈現(xiàn)明顯的量效依賴關(guān)系，說明補(bǔ)益營衛(wèi)方藥能促進(jìn)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞增殖,且增殖程度隨著補(bǔ)益營衛(wèi)藥物血清濃度的增高而相應(yīng)增高，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。最后的總結(jié)應(yīng)精煉參考文獻(xiàn)：1 周小平,傅延齡.營衛(wèi)與皮膚及皮膚衰老的關(guān)系探討J.四川中醫(yī),2008,26(4):22-23.2 蔡霞,高學(xué)軍,張鵬,等.體外培養(yǎng)不同代次人皮膚成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究J.解剖科學(xué)進(jìn)展,2005,11(3):234-236.3 蔡霞,高學(xué)軍,張鵬,等.體外培養(yǎng)不同代次人成纖維細(xì)胞的衰老程度J.中國臨床康復(fù),2005,26(9):60-63.4 郝小惠,郭志義,張銀紅,等.姜黃素對(duì)人肺成纖維細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 J.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2011,6(24):412.5 周小平,馬燕紅,傅延齡.健脾胃、補(bǔ)營衛(wèi)抗皮膚衰老作用實(shí)驗(yàn)研究J.2006,4(15):455.期刊名？6 周小平,馬燕紅,傅延齡.健脾補(bǔ)肺對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠皮膚衰老模型影響的實(shí)驗(yàn)研究J.2007,2(16):254.補(bǔ)期刊7 G