植物組培培養(yǎng)基

1、關(guān)于植物組培的培養(yǎng)基第一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月目的要求：一、掌握培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)三、掌握培養(yǎng)基的組成和其適宜劑量二、掌握MS培養(yǎng)基配制四、理解培養(yǎng)基篩選方法第二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 培養(yǎng)基的種類和成分 一、培養(yǎng)基種類 二、培養(yǎng)基成分 第二節(jié) 培養(yǎng)基制備 一、母液配制和保存 二、培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 一、單因子試驗(yàn) 二、多因子試驗(yàn) 三、逐步增減法 四、廣譜實(shí)驗(yàn)法第三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、培養(yǎng)基的種類 1、根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基中加入一定量的

2、凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)容器中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。 液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。 第四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)基種類 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)分布均勻，生長(zhǎng)整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營(yíng)養(yǎng)分布不均，生長(zhǎng)發(fā)育不整齊。 二者比較第五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程 培養(yǎng)基分為： 初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基 外植體：從植物體上取出的用于無菌培養(yǎng)的植物材料。 植物材料：莖尖、莖段、花瓣、葉子、花藥等 第六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月初代培養(yǎng) ：指用來第一次接種從植物體上分離下來的外植體過程 。繼代

3、培養(yǎng)：對(duì)培養(yǎng)物(包括細(xì)胞、組織或其切段)通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進(jìn)行連續(xù)多代的培養(yǎng)，就稱為繼代培養(yǎng)。第七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為： 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基 4、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。 基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。 完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。第八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用培養(yǎng)基種類 MS培養(yǎng)

4、基 B5培養(yǎng)基White培養(yǎng)基 N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基第九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 有機(jī)成分復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素 用于原生質(zhì)體培養(yǎng)( 包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))KM-8P培養(yǎng)基特點(diǎn)：第十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月N6培養(yǎng)基特點(diǎn)：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)成分簡(jiǎn)單KNO3 和 (NH4)2SO4含量高廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)等 第十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月White培養(yǎng)基特點(diǎn)：1943年由hite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作hite改良培養(yǎng)基 。特點(diǎn)：無機(jī)鹽含量較低適用：生根

5、培養(yǎng)。第十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月B5培養(yǎng)基特點(diǎn)：含較低的銨雙子葉植物 尤其木本植物組培可選擇 第十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月MS培養(yǎng)基特點(diǎn)：無機(jī)鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。 MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培生長(zhǎng)所需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡 第十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、 培養(yǎng)基成分 水 植物激素 無機(jī)鹽 有機(jī)物培養(yǎng)體支持材料 輔助性物質(zhì)第十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、無 機(jī) 鹽 氮 枝葉生長(zhǎng)

6、需要氮素，缺氮老葉先發(fā)黃；氮過量，枝葉過度茂盛 。磷 缺磷，植株生長(zhǎng)緩慢，老葉暗紫色。鉀 促進(jìn)花卉生長(zhǎng)健壯，增強(qiáng)抗性，莖稈挺拔。缺鉀，葉尖、葉緣枯焦，葉片呈皺曲狀，老葉發(fā)黃或火燒狀。鈷 缺鈷，葉片失綠而卷曲，整個(gè)葉片向上彎曲凋枯。第十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、有機(jī)物維生素肌醇氨基酸天然復(fù)合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物馬鈴薯汁液其它第十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月碳水化合物選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖濃度：2%3%，胚培養(yǎng)為4%15%大生產(chǎn)時(shí)可用白糖第十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 糖在培養(yǎng)基的作用： 1

7、）為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2）為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量 3）維持滲透壓第十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月種類： VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、 VB3（煙酸）、Vc（抗壞血酸 濃度：0.11.0mg/L 作用：VB1 促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力VB6 促根生長(zhǎng) Vc 防組織褐變 VB3 與植物代謝和胚的發(fā)育有關(guān)系 維生素第二十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其種類和濃度不同。 肌醇：又稱環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起作用 第二十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2

8、022年6月名稱分子量溶解性質(zhì)性質(zhì)蔗糖342.30溶于水、乙醇無變旋現(xiàn)象山梨糖180.16溶于水甜味與蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有變旋現(xiàn)象，以游離態(tài)或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有變旋現(xiàn)象，甜度高于蔗糖鹽酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高溫影響小，可高溫消毒核黃素（VB2）376.37溶于無水乙醇、微溶于水等電點(diǎn)PH=6.0，堿性溶液中易變質(zhì)，光能加速變質(zhì)鹽酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇對(duì)光、空氣、熱穩(wěn)定是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶鈷胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高溫影響小，可高溫消毒，參與絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼徇^程煙酸（VPP）123.11極易溶于

9、水、乙醇對(duì)空氣、光、熱、PH值穩(wěn)定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇對(duì)空氣溫度穩(wěn)定葉酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水參與生物甲基化作用抗壞血酸（VC）176.12極易溶于水有較強(qiáng)的還原能力，可做抗氧化劑用，參與酪氨酸代謝及色氨酸的羥基化作用肌醇180.16易溶于水植物中廣泛存在，可能與IAA的代謝有關(guān) 常見糖和維生素及其主要性質(zhì)第二十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量1020%，使用注意莖尖大小香蕉泥：用量150 200ml/L ，應(yīng)用在蘭花組培馬鈴薯汁液：用量150200g/L，使苗壯水解酪蛋白：濃度100200mg/L，應(yīng)用在

10、微莖尖培養(yǎng)天然復(fù)合物第二十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 自然界中，植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許多生理生化活動(dòng)。 在培養(yǎng)基中，其各種成分對(duì)培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會(huì)顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等。 通常，不同植物，或不同品種，甚至同一植物的不同位置對(duì)激素的要求有很大的變化，這主要取決于植物的內(nèi)源激素水平。 組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧

11、乙酸（2，4D）三、激素第二十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）、激素的種類： 1、生長(zhǎng)素類： 在自然界中，生長(zhǎng)素影響莖和節(jié)間的伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象 在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織） 第二十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素： 1 二氯苯氧乙酸（2，4D） 2 萘乙酸（NAA） 3 吲哚乙酸（IAA） 4 吲哚3丁酸（IBA） NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。 IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時(shí)間不要太久。 溶解方法：1M NaOH或95酒精

12、，以前者為好 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第二十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細(xì)胞分裂素 自然界中，細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂，頂端優(yōu)勢(shì)的變化和莖的分化等 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長(zhǎng)素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官形成。 常用的細(xì)胞分裂素有： 6芐氨基嘌呤（6BA） 激動(dòng)素（6-糠氨基嘌呤、 KT） 玉米素（ZT） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ） 溶解方法：1MHCL 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第二十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、赤霉素 由日本

13、人黑澤1926年發(fā)現(xiàn)。自然界中，赤霉素能夠打破休眠、促進(jìn)果實(shí)成長(zhǎng)等效果。雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報(bào)道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。 赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3。在組織培養(yǎng)中與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相比，赤霉素不太常用，據(jù)報(bào)道赤霉素能刺激不定胚正常發(fā)育成小植株 溶解方法：95酒精 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解 滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌第二十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4、脫落酸 在自然界中

14、，脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用。 經(jīng)試驗(yàn)表明，脫落酸有利于胚性愈傷組織形成正常不定芽。 材料的試管保存，加上脫落酸能抑制生長(zhǎng)，使繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。 溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。 配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第二十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型激 素 配 方 再生方式及用途1.無植物激素誘導(dǎo)生根、無性胚、愈傷組織形成2.單加生長(zhǎng)素誘導(dǎo)生根、愈傷組織、無性胚、不定芽3.單加細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖、愈傷組織形成4.高生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長(zhǎng)素

15、高細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)叢芽、愈傷組織形成6.低生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖7.等量生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)側(cè)芽增殖8.加生長(zhǎng)抑制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長(zhǎng)、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進(jìn)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)第三十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月名稱 分子量 溶解性質(zhì) 主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進(jìn)細(xì)胞的延伸生長(zhǎng)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松馳，也可用于誘導(dǎo)生根 吲哚丁酸 (IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀堿、稀酸液為生根刺激劑 a-萘乙酸 (NAA)186.20 易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，刺激生根2,4-二氯苯氧乙

16、酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進(jìn)愈傷組織形成 赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進(jìn)莖、葉伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，打破休眠 （三）、常見生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表第三十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）、常見生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.405

17、40.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.5768

18、1.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173第三十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂用量710g/L（0.7%-1%）注意：1 若濃度過高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就難于擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中。 2 當(dāng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)需要研究時(shí)，應(yīng)注意不要使用瓊脂，因?yàn)槭袌?chǎng)供應(yīng)所有瓊脂含有雜質(zhì)，特別是含有Ca,Mg和微量元素。2.其它 卡拉

19、膠、玻璃纖維、濾紙橋、海綿等第三十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、輔助性物質(zhì)1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭第三十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 抗生素1.常用種類：青霉素鏈霉素 慶大霉素等2.用量：5%20%3.作用：防止由外植體內(nèi)生菌造成的污染。4 過濾滅菌 第三十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月抗氧化物常用抗氧化劑及使用：半胱氨酸VC（50200mg/L液洗滌外植體傷口表面）?；钚蕴?.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1 0.2%）；促進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.510g/L3

20、.活性炭的作用 對(duì)生長(zhǎng)的抑制：其吸附了植物激素 對(duì)生長(zhǎng)的刺激：其吸附了有抑制作用的物質(zhì)第三十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 培養(yǎng)基配制一、母液配制與保存二、培養(yǎng)基配制第三十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月(一)母液配制流程圖 稱 量 母液分裝確定培養(yǎng)基 溶 解 定 容 貼標(biāo)簽保存于冰箱一、母液配制 (以MS為例)第三十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 稱量藥品 天平預(yù)置全顯示清 零稱 藥第三十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)母液配制要求：1.母液濃縮倍數(shù)：10-100 ，大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機(jī)物50；2.選用蒸餾水、重蒸

21、餾水、分析純或化學(xué)純?cè)噭?.防止沉淀4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100 ml5.激素溶解： IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容； NAA先溶于熱水或95%酒精再加水； 2，4-D先溶于1M NaOH再加水； KT、BA先溶于1M HCl再加水。 第四十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要配制母液？ 1）方便 2）準(zhǔn)確（有些成分量太?。?3）母液要分類配， 否則有些成分混合一起會(huì)產(chǎn)生沉淀 以MS培養(yǎng)基為例：第四十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月MS培養(yǎng)基母液的配制第四十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月母液保存：在冰箱內(nèi)低溫保存第四十三

22、張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、培養(yǎng)基配制移母液調(diào)PH值培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口定容分裝二次定容接種確定配方第四十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 大量元素母液 微量元素母液 鐵 鹽母液 有機(jī)物母液 取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培養(yǎng)基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸進(jìn)吸氣球里，數(shù)量看準(zhǔn)，不滴不漏，吹凈為度。移母液第四十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月用自來水定容至1升定 容：第四十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月稱取蔗糖、瓊脂用自來水定容到1升取蔗糖2530g，瓊脂78g。第四十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月

23、培養(yǎng)基熬制：3.將容量瓶中剩余的液體一并倒入鋁鍋中，搖晃使均勻。1.將定容好的培養(yǎng)液取1/3倒入鋁鍋中，同時(shí)加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。第四十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為6.0。調(diào)PH值：第四十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月分裝：趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入3040ml 。第五十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月扎口與滅菌:要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，防止變質(zhì)。第五十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 滅菌后，應(yīng)盡快地轉(zhuǎn)

24、移培養(yǎng)瓶使其冷卻，一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)基儲(chǔ)藏于30以下的室內(nèi)名，最好儲(chǔ)藏在410的條件下。 應(yīng)當(dāng)注意的是，某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA、ZT、ABA等以及某些維生素是不穩(wěn)定的，不能和其他的培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而要進(jìn)行過濾滅菌。第五十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇一、單因子試驗(yàn)二、多因子試驗(yàn)三、逐步增減法四、廣譜試驗(yàn)法第五十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合 6BA（mg/L)A1 A2 A3 A4 A5 NAA（mg/L)B1B2 B4 B3B5B1A1 B1A2 B1A3 B1A4 B1A5B2A1 B2A2 B2A3 B2A4 B2A5B3A1 B3A2 B3A3