核酸分離純化

1、關(guān)于核酸的分離純化第一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 分子生物學(xué)研究之所以從20世紀(jì)中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術(shù)第二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程誕生的基礎(chǔ)1、理論上的三大成就2、技術(shù)上的二大發(fā)明第三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三大成就 ：1. 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；1928 Frede

2、rick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗第四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；X-ray sourceCrystallized DNARosalind Franklin拍出 了第一張能反映DNA美麗雙螺旋結(jié)構(gòu)的X射線照片 Maurice WilkinsPhotographicfilm1953- Franklin &

3、 Wilkins第五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Description of the 3-D structure of DNAFrancis Crick & James Watson三位科學(xué)家因為對這一 成果的貢獻，共享1962年的諾貝爾生物學(xué)獎 第六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Conservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958 -Matthew Meselson & Franklin St

4、ahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway第七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。Jacob and Monod第八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。 第九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限

5、制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶（DNA ligase ）第十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一把特殊的剪刀限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎第十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Herbert Boyer,Stanley Cohen1972年獲得第一個重組DNA分子(實現(xiàn)不同來源DNA的重組)Herbert Boyer第十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1972 - Paul BergProduced first recombinant DNA u

6、sing EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA第十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanam

7、ycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies第十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù) DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)

8、的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。第十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月General process of gene engineering1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴

9、增的目的基因。第十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。第十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線第十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細胞） 篩（選陽性克?。?表（達目的基因）第十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 核酸的分離純化第二十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月主要內(nèi)容 前言一、核酸分離、純化原則（

10、一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀 (四）核酸的濃度測定（五）核酸的保存第二十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前 言第二十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1 意義 遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的

11、形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 2 分離核酸原則： 1）溫度不要過高； 2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9); 3）保持一定的離子強度; 4）減少物理因素對核酸降解的機械剪切力.第二十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）防止核酸的生物降解 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。第二十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 DNA酶抑制劑1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-N

12、a2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2） 陰離于型表面活性劑： 如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。第二十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2 RNA酶（RNAase)抑制劑 RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。 第二十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。 作用機

13、制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒。第二十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（3) 肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)第二十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二 分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎 1 高速組織搗碎機搗

14、碎 2 玻璃勻漿器勻漿 3 超聲波處理法 4 液氮研磨法 5 化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等） 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）第二十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。第三十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用方法： 1 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使

15、核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能； 第三十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。第三十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸

16、的磷酸二酯鍵。 2）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。使用酚時應(yīng)注意第三十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）核酸的沉淀 沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。第三十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 核酸沉淀的鹽類及濃度第三十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2 有機沉淀劑 （1）乙醇優(yōu)點： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。第三十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）異丙醇優(yōu)點： 需

17、體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70乙醇漂洗數(shù)次。第三十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。第三十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）精胺 精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DN

18、A。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達到純化DNA的目的。第三十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3 核酸沉淀的溫度和時間 一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達到實驗要求。第四十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(四）核酸的濃度測定 1 紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。 結(jié)論：在波長260

19、nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 ug/ml。第四十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1g / ml時，DNA鈉鹽的OD2600.02當(dāng)OD2601時，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml第四十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：核酸在260nm

20、處有最大吸收峰蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰OD260/OD2801.7OD260/OD2302.01 OD260=50 g/mL DNA第四十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積 后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b分光光度計先用一定量的水校正零點。c測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d計算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000； RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40/1000。e分析