提取基因組與原理

1、關(guān)于提取基因組和原理第一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月破膜：釋放出目的核酸分子分離：通過酶、有機溶劑、調(diào)節(jié)pH值、離心等手段得到粗制品純化：去除雜質(zhì)，純化目的核酸。三個過程： 破膜、分離、純化第二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月ULtraPureTMgDNA快速抽提試劑盒在高鹽狀態(tài)下，DNA純化樹脂ULtraPureTM專一性地吸附DNA;在低鹽或水溶液狀態(tài)下,DNA被洗脫下來第三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、試劑純化樹脂（于GN結(jié)合液中）GN結(jié)合液漂洗液離心純化柱（空柱子）無水乙醇TE緩沖液：Tris-HCl（pH7.6) Tris:三羥甲基氨基甲烷 E

2、DTA （pH8.0)乙二胺四乙酸第四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、操作過程1、混勻全血，1ml樹脂中加0.5ml全血,顛倒混勻5-6次。室溫下溫育3分鐘，其間顛倒混勻1次，5，000rpm離心3秒，棄上清。2、加入1mlGN結(jié)合液，懸浮上述樹脂，顛倒混勻，5，000rpm離心3秒，棄上清。3、取0.5ml漂洗液漂洗樹脂兩次,顛倒混勻，5，000rpm離心3秒，棄上清。第五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月如果樹脂仍然呈黃色或褐色，重復(fù)3步1-2次。4、加入0.8ml無水乙醇,懸浮樹脂,裝入離心純化柱,13,000rpm離心1分鐘,倒掉乙醇,再離心1分鐘,盡量除盡乙醇。

3、5、將純化柱套入一個干凈的1.5ml離心管中，加100lTE于純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3分鐘， 13,000rpm離心2分鐘。第六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6、收集離心管中洗脫下來的gDNA，取2 l電泳（1%瓊脂糖，120V，20分鐘）檢測。其余-20 保存?zhèn)溆?。注意：離心時保持平衡。7、紫外分光光度計測量核算的濃度及純度。（測A260與A280值）第七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗前注意事項:1、所有微量離心管(eppdorf)、槍頭（tip）必須高壓滅菌。2、微量移液器的使用：看清刻度、輕旋、輕放。3、取不同的試劑、樣品須更換tip。4、純

4、化樹脂（于GN結(jié)合液中）為灰褐色粉狀物質(zhì)，靜置時沉淀于瓶底，使用時要充分混勻。5、室溫低于25 時，純化樹脂與GN結(jié)合液可能出現(xiàn)結(jié)晶或鹽析，請務(wù)必預(yù)熱，完全溶解后使用。第八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月QuickGene Mini80 與DNA全血試劑盒一、樣本抽提前儀器安裝準備1 正確安裝好各個儀器配件，接上電源。2 把試劑盒內(nèi)的廢液管、收集管和帶膜的套管放在儀器配件的正確位置上二、DBS試劑盒第一次使用前準備工作1 向EDB干粉中添加3.3ml無菌水，混勻室溫靜置30min2 向WDB緩沖液中加入160ml無水乙醇第九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、樣本處理及血液

5、基因組DNA純化1. 取一新的15ml或50ml離心管，依次加入300ml EDB溶液、2ml全血、2.5ml LDB溶液2. 上下顛倒混勻10次，2500rpm渦旋震蕩15sec3. 56水浴5min4. 加入2.5ml無水乙醇5. 上下顛倒混勻10次，2500rpm渦旋震蕩15sec6. 將處理過的全血倒入QuickGene-610L的帶膜的套管內(nèi)7. 上機，第一次抽提選擇模式“DNA WHOLE BLOOD”，按“start”開始8. 第二次抽提選擇模式“INSOLUTION A”第十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、測DNA濃度與純度五、將抽提好的DNA 立即使用或保存于-

6、20冰箱中，按實驗室說明丟棄其他管子。第十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR原理第十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR定義:polymerase chain reaction ，聚合酶鏈式反應(yīng).簡單的說，PCR就是利用TaqDNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi) (In Vitro) 的大量合成?；旧纤抢煤铣傻腡aqDNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制.目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。第十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的要件一、基本原理PCR技術(shù)是利用DNA聚合酶在體外條件下,催化一對引物之間特異DNA片段合成的基

7、因擴增技術(shù)。包括三個基本過程：第十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 DNA的變性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團樣結(jié)構(gòu)的過程。第十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月解鏈溫度（融解溫度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈是在一個相當窄的溫度內(nèi)完成的。第十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6

8、月增色效應(yīng)： DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。第十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的復(fù)性（renaturation)： 在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火(annealing)。第二十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月減色效應(yīng)：變性DNA復(fù)性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。第二十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 常用的變性方法： 熱變性 酸堿變性 化學(xué)試劑變性 第二十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于202

9、2年6月2. 影響復(fù)性的因素 序列簡單的分子復(fù)性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快 DNA片段愈大，擴散速度愈低，復(fù)性慢 離子強度有利于復(fù)性 DNA濃度復(fù)性 Tm值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%） 第二十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的基本成分：1 熱穩(wěn)定DNA聚合酶：催化模板依賴的DNA合成。熱穩(wěn)定DNA聚合酶的選擇：主要依據(jù)合成大片段DNA產(chǎn)物需要的保真度、效率及合成能力而決定。常規(guī)PCR，TaqDNA 聚合酶是常用酶。2 一對引導(dǎo)DNA合成的寡核苷

10、酸引物：設(shè)計目的：獲得高產(chǎn)率的目的擴增物，抑制非特異序列的擴增。第二十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3 脫氧核苷三磷酸（dNTP）：標準PCR反應(yīng)體系中包含4中等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸。4 二價陽離子：常用鎂離子用于激活，適當增加鎂離子可減少非特異性引導(dǎo)。5 維持PH值的緩沖液：室溫下標準緩沖液的PH值為8.38.8之間，72時反應(yīng)體系的PH值下降1個多單位，PH值接近7.2。第二十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6 一價陽離子：標準PCR緩沖液內(nèi)包含有50mmol/L KCl ，適于大于500bp長度的DNA 片段。提高KCl 濃度在70100mmol/L ，適于

11、較短的DNA 片段。7 模板DNA：當使用高分子量的DNA（10kb）做模板時，如用限制性內(nèi)切酶先行消化（此酶不應(yīng)切割靶序列）則擴增效果更好。第二十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基本PCR中寡核苷酸引物的設(shè)計原則：A 堿基組成：G+C含量應(yīng)在40%和60%之間，4種堿基在引物中分配均勻沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且沒有二核苷酸重復(fù)序列。B 長度：引物中與模板互補的區(qū)域應(yīng)該為1825個核苷酸長度。上下游引物的長度差別不能大于3bp。C 不能有大于3bp的反向重復(fù)序列或自身互補序列存在。這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如果這種結(jié)構(gòu)在PCR條件下穩(wěn)定，它會非常有效地阻止寡核苷酸和靶DNA之

12、間的復(fù)性。第二十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月D 解鏈溫度（Tm）：兩個引物的Tm值相差不能大于5，擴增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10。保證擴增產(chǎn)物在每個PCR循環(huán)可有效變性。E 3末端：3末端堿基最好是G或C，但不應(yīng)是NNCG或NNGC。因為末端GC含量高可促進發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。F 上下游引物的互補性：一個引物的3末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上，避免引物二聚體的形成和擴增。第二十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR溫度條件的設(shè)計：1 模板的熱變性溫度和時間：雙鏈DNA模板的變性溫度由其G+C含量決定。DNA分子越長，兩條

13、鏈完全分開所需的時間也越長。應(yīng)用Taq DNA聚合酶時，變性一般在9495下，這是Taq DNA聚合酶進行30或以上PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失所能耐受的極限溫度。第三十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2 引物和模板DNA的復(fù)性：復(fù)性溫度過高，寡核苷酸引物不能與模板很好復(fù)性，擴增效率降低；復(fù)性溫度太低，非特異性DNA片段擴增增加。3 寡核苷酸引物的延伸：常在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化DNA合成的最適溫度下進行。對Taq DNA聚合酶來說最適溫度是7278。第三十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)特點特異性強靈敏度高簡便、快速對標本的純度要求低第三十二張，PPT共

14、七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月特異性強關(guān)鍵：引物與模板的正確結(jié)合引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高第三十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)的特異性決定因素引物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保守性第三十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月靈敏度高PCR 產(chǎn)物的生成量

15、是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 ( pg=10-12 ) 量級的起始待測模板擴增到微克( ug=10-6)水平從 100 萬個細胞中檢出一個靶細胞在病毒的檢測中，PCR 的靈敏度可達 3 個RFU (空斑形成單位) 在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌第三十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA 擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣第三十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月對標本的純度要求低不需分離病毒或

16、細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總 RNA 均可作為擴增模板可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測第三十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月熱啟動PCRTouch-down PCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不對稱PCR原位PCR連接酶鏈反應(yīng)RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特異PCR第三十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1）不對稱PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵

17、是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針； 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 PCR的類型第三十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 高濃度引物低濃度引物第四十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2)反向PCR (reverse PCR) 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 未知序列未知序列已知序列第四十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第四十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第四十

18、三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳引物12341234第四十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對引物進行標記, 用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分第四十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月標記引物觀察PCR產(chǎn)物第四十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5）錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC

19、)一起作PCR擴增第四十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC 錨定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC第四十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作第四十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月7）原位 原位聚合酶鏈式反應(yīng)（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂

20、片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。第五十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟1. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2. PCR擴增細胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達第五十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月8）逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第五十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9) 熒光定量 PCR（real-time PCR) 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR

21、產(chǎn)物進行標 記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)第五十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green I 第五十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 實時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀第五十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的運用PCR除了

22、是一個診斷工具外，更重要的是它有廣泛的運用。PCR本身可直接用來鑒定特定基因的存在與否，也可以用來偵測基因是否有異常 (Gene mutation, deletion, and rearrangement)。例如，在醫(yī)學(xué)上對遺傳疾病或腫瘤癌癥的診斷及預(yù)后的評估； 對細菌、病毒及霉菌感染的診斷。它也可成為一個生產(chǎn)線進而大量復(fù)制特定的基因進行基因密碼的讀取 (DNA sequencing) 及其它的運用。第五十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月舉凡對生物標本及法醫(yī)學(xué)上的樣本鑒定，從單一毛發(fā)、一只精蟲或一滴血液、唾液來找出兇手。 也可以做DNA指紋 (Fingerprints) 比對幫助親

23、子關(guān)系的鑒定。PCR更可以用于器官移植組織兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，經(jīng)由PCR的運用也產(chǎn)生重大的進展。近來，在生物醫(yī)學(xué)的研究上，特別是細胞間訊息的傳遞分子，諸如介白質(zhì) (Interleukines) 及各種生長因子 (Growth factors) 基因的表現(xiàn)都可用PCR來進行質(zhì)與量的分析。第五十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠電泳依據(jù)制備凝膠的材料，凝膠電泳可被分成兩個亞類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。相比之下，瓊脂糖凝膠在分離度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分離范圍上優(yōu)于聚丙烯酰胺。一般，瓊脂糖凝膠適用于分離大小在0.250kb范圍內(nèi)的DNA片段。 第五十

24、八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂糖凝膠電泳一、基本原理：核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點的電泳緩沖液中（pH8.0-8.3)，其堿基不解離，而磷酸全部解離，核酸分子帶負電荷，向正極移動。不同大小和構(gòu)象的核酸分子所帶電荷量大致相同。在自由泳動時難以分開，采用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達到分離目的。第五十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、主要試劑瓊脂糖6X上樣緩沖液（loading buffer）10mg/ml溴已錠(EB)10倍濃縮的TBE電泳緩沖液配方如下: Tris108 g ED

25、TA 9.3 g 硼酸55 g用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為8.08.2備用，使用時需稀釋10倍 第六十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月表1-1瓊脂糖凝膠濃度與分離DNA分子大小的范圍瓊脂糖凝膠濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(千堿基對，kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.242.00.13第六十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值及離子強度直接影響電泳的效率。常用的有Tris-醋酸（TAE）、 Tris- 硼酸（TBE） Tris- 磷酸（TPE）。第六十二張，PPT共

26、七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6X上樣緩沖液（Loading buffer）組成：0.25%溴酚藍、 0.25%二甲苯青、 40%蔗糖作用：能夠增加樣品密度，確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見的藍紫色和藍色指示帶，從而幫助預(yù)測核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍紫色，使加樣操作更方便。 第六十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月溴化乙錠（EB）（染色劑）核酸電泳后，需要染色才能在紫外線下觀察到帶型。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，有劇毒，因此操作時要非常小心。EB可嵌入DNA雙鏈的堿基之間，在紫外線激發(fā)下能發(fā)出橙紅色熒光，見光易分解,棕色瓶保存于4 ,使用終濃度0.

27、5g/mL。第六十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、操作步驟1、選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢查穩(wěn)壓電源與正負極的線路。2、用透明膠帶紙將tank兩端封好，選擇孔徑大小適合的梳板，垂直架于tank的一端。3、制備瓊脂糖凝膠，稱取適量瓊脂糖，溶解在0.5XTBE中,置微波爐中加熱,均勻溶解瓊脂糖。第六十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4、加入EB（0.5g/mL），搖勻，待凝膠冷卻至50 左右，倒入tank中，室溫下冷卻凝固。避滅產(chǎn)生氣泡。5、撕去兩端的透明膠帶紙，將tank和凝膠一起放入電泳槽內(nèi)。在電泳槽內(nèi)加入0.5XTBE，使緩沖液蓋過膠面，小心取出梳板，保持點樣