實驗一果蠅性狀觀察與雌雄鑒別

1、PAGE 28實驗一：果蠅性狀觀察與雌雄鑒別一、實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)區(qū)別雌雄蠅和觀察果蠅主要性狀，掌握制備果蠅飼料和進行果一般方法。二、實驗原理：果蠅為雙翅目昆蟲，用作實驗材料的優(yōu)點是:生長迅速,生活周期短,沒12天左右即可完成一個世代;繁殖力較強,每只受精的雌蠅均可產(chǎn)卵400-500個;因此在短期內(nèi)即可獲得多數(shù)子代，有利于遺傳學(xué)分析；培養(yǎng)條件簡易可行；其突變形狀多屬形態(tài)變異，便宜觀察，因此，果蠅在遺傳學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。三、實驗材料、用具和試劑：飼養(yǎng)的野生型和幾種常見的突變型果蠅。雙筒解剖鏡，放大鏡，飼養(yǎng)瓶或飼養(yǎng)管，麻醉瓶，白瓷板，棉塞，玻璃棒，鑷子，大燒杯，酒精燈。三腳架，石棉網(wǎng)，標(biāo)簽，新毛筆

2、，酒精棉球，吸水紙，玉米粉，瓊脂，葡萄糖，酵母（原液或干粉），乙醚，丙酸或乳酸，死蠅盛留器，膠水四、實驗內(nèi)容和步驟：一）、制備飼料：1、準(zhǔn)備作為飼養(yǎng)瓶的廣口瓶或玻璃管（消毒、干燥）并按飼養(yǎng)器口部大小制備棉塞（消毒）2、果蠅的幼蟲和成蟲的主要食物，都是飼料內(nèi)繁殖的酵母菌。按照下表成分和下述方法制備飼料。常用的果蠅飼料及成分玉米粉飼料米粉飼料水100ML100ML瓊脂11G115G糖10G10G玉米粉11G酵母菌夜（或粉）數(shù)滴數(shù)滴殺霉劑（丙酸或乳酸）12滴12滴米粉10G按配方之比例稱量所需物品。先用定量中2/3的水將瓊脂煮化，再加糖，溶化；再將玉米粉混合于1/3水內(nèi)，攪勻后傾入瓊脂糖夜中，一同煮

3、沸，并隨時用玻璃棒攪動，待煮沸數(shù)分鐘，飼料成為可流動的漿糊狀時，即傾入飼養(yǎng)器內(nèi)。每一飼養(yǎng)器內(nèi)的飼料厚度約為2CM即可。傾入飼料時，應(yīng)注意勿使飼料傾在飼養(yǎng)瓶內(nèi)的側(cè)壁上，以免粘著果蠅。每一飼養(yǎng)器內(nèi)裝好飼料后，立即塞好棉塞，直立在一旁。 （兩天后）待凝后，用鑷子夾酒精棉球（擰干）將器內(nèi)側(cè)壁上的水珠和飼料擦干凈，滴入12滴殺霉劑，并轉(zhuǎn)動飼養(yǎng)瓶，使殺霉劑均勻分布于飼料表面，然后滴入或撒入酵母液或干粉，使其均勻分布于飼料表面。然后再在飼料內(nèi)插上消毒的吸水紙（作用是吸取水分和供給幼蟲化蛹的場所），塞好棉塞，放置于258左右的恒溫箱內(nèi)待用。為了保證酵母菌和果蠅的良好生長和繁殖，必須注意防止霉菌和其他細(xì)菌在飼養(yǎng)

4、瓶內(nèi)繁殖，使用的殺霉劑只有一些抑制霉菌生長的作用，而無絕對防止的作用，因此關(guān)鍵在于各項操作中，嚴(yán)格消毒和滅菌。二）、觀察果蠅性狀和雌雄鑒別1、將準(zhǔn)備觀察的果蠅傾入用作麻醉瓶的干燥廣口瓶內(nèi)，麻醉瓶的口部大小與飼養(yǎng)瓶口部大小一致，以便傾入果蠅時，果蠅不致飛出。傾倒果蠅時，可將麻醉瓶的底部朝向光亮處，果蠅喜向光亮處飛集，能自然逐漸飛入麻醉瓶內(nèi)。（或?qū)⒙樽砥孔粤⒆郎希b有果蠅的飼養(yǎng)瓶口對口倒置于麻醉瓶上，用手親拍飼養(yǎng)瓶，果蠅即進入麻醉瓶內(nèi)。）2、在原先制好的麻醉棉塞上滴上幾滴乙醚，立即將麻醉棉塞塞好已裝有果蠅的麻醉瓶，等待35分鐘，果蠅都停止不動，即可取去麻醉棉塞，將果蠅傾出觀察。如果用作雜交親本或繼

5、續(xù)飼養(yǎng)的果蠅不能麻醉過度，以免致死（果蠅被麻醉后，若雙翅外展呈45角，即已致死）。如果麻醉不夠，中途蘇醒，可再麻醉。3、將已麻醉的果蠅，傾于白瓷板上（或白紙上），置于雙筒解剖鏡或擴大鏡下觀察其主要性狀,注意認(rèn)清每一果蠅的復(fù)眼顏色，身體顏色，翅的長短及雌雄鑒別。 成蠅的雌雄性別的主要區(qū)別；雌果蠅：體型較大腹部末端稍尖腹背面外觀有5條黑色條紋無性梳外生殖器外觀較簡單雄果蠅：體型較小腹部末端頓圓3)腹背面外觀有3條黑色條紋(兩窄一寬)有性梳外生殖器外觀較復(fù)雜五、實驗報告內(nèi)容：1、制備的飼料種類和飼養(yǎng)瓶（管）數(shù)個 2、觀察到的果蠅體色，翅形，復(fù)眼顏色及雌雄成蠅的外形特征（記看要點并簡單圖示） （附：果

6、蠅的生活史） 果蠅的生活史包括卵，爬幼蟲，蛹和成蟲四個階段。卵：羽化后的雌蠅一般在12小時后開始交配，兩天后才能產(chǎn)卵，卵長約0.5毫米，橢圓形，腹面稍扁平，在背面的前端伸出一對觸絲，它能使卵附著在食物或瓶壁上，不致深陷到食物中。幼蟲：幼蟲從卵中孵化出來后，經(jīng)過兩次蛻皮到第三齡，此時體長科達到45毫米，肉眼觀察下可見一端稍尖為頭部，并且有一黑點即口器，稍后有一對半透明的唾腺，每條唾腺前有一個唾腺管向前延伸，然后匯合成一條導(dǎo)管通向消化道，神經(jīng)節(jié)位于消化道前端的上方。通過體壁，還可以看到一對生殖腺位于身體后半部的上方兩側(cè)，精巢較大，外觀為一明顯的黑色斑點，卵巢則較小，熟悉觀察后可借以鑒別雌雄。幼蟲的

7、生活力強而貪食，在培養(yǎng)基上前進時便留下一道溝溝，溝多而寬時，表明幼蟲生長良好。蛹：幼蟲生活78天后即化蛹，化蛹前從培養(yǎng)基上初附在瓶壁上，漸次形成蛹，起初顏色淡黃，柔軟，以后逐漸硬化，變?yōu)樯詈稚?，這就將要明顯羽化了。成蟲：剛從蛹?xì)だ镉鸹龅墓墸x體較長大，翅膀還沒展開，體表也沒有完全角質(zhì)化，所以呈半透明的乳白色，透過腹部體壁還可看到消化腺和性腺，不久，蠅體變?yōu)榇侄虣E圓形，雙翅展開，體色加深，如野生型果蠅起初為淺灰色，而后成為灰褐色。果蠅全部生活史所需的時間，常因飼養(yǎng)溫度和飼養(yǎng)條件等而有所不同。當(dāng)營養(yǎng)條件適宜時，在20下飼養(yǎng)，卵幼蟲期平均約為8天，蛹成蟲期約為6.3天，若在25下飼養(yǎng)，卵幼蟲期平

8、均約為5天，蛹成蟲期僅需4.2天。因此當(dāng)營養(yǎng)條件適合而在25下飼養(yǎng)，只需10天就可完成一代生活史。普通果蠅的最適宜溫度為2025，當(dāng)溫度低于10時，生活周期將延長至57天以上，而且生活力明顯降低，如果高于30時則將引起不育和死亡。實驗二：果蠅一對相對性狀的遺傳分析分離規(guī)律的驗證一、實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握果蠅雜交技術(shù)，驗證分離定律二、實驗原理： 一對相對性狀的遺傳方式是F代表現(xiàn)親本之一的顯性性狀；F代在形成配子時由于成對因子的分離而造成F1代性狀的分離。F代配子與分離比是1：1，F(xiàn)1代性狀分離比為3：1.三、實驗材料，用具及試劑： 純系的野生型及不同的突變型處女蠅：灰身、黑身，檀黑身，黃身，長翅

9、，殘翅等。雙筒解剖鏡（放大鏡）、培養(yǎng)瓶，麻醉瓶，乙醚，白瓷板，毛筆，標(biāo)簽，膠水，死蠅盛留器。四、實驗內(nèi)容和步驟：實驗雜交的雌蠅應(yīng)為處女蠅：雌蠅孵出后一般在12小時內(nèi)不進行交配，因此獲得處女蠅的方法是：將已孵化出的果蠅從培養(yǎng)瓶中全部移走（注意一個也不能留下），以后12小時內(nèi)孵出的雌蠅均為處女蠅，即可分別收集雜交親本用。（如能在八小時內(nèi)收集更為可靠）一般于前一天晚上八點以后將所有果蠅從培養(yǎng)瓶中移走，第二一天八點收集到的雌蠅均為處女蠅。1、選取殘翅 （Vg/Vg）處女蠅和野生型（+/+）處女蠅作為雜交親本（或其他具相對性狀的類型） ，正反交，各培養(yǎng)一瓶，每一瓶45對，記作P，進行雜交組合飼養(yǎng)。 具體

10、方法：按上次實驗的麻醉方法，將選取的處女蠅麻醉（注意不能麻醉過度，以免致死），再將已麻醉的處女蠅倒在白瓷板上（或白紙上）置于解剖鏡下觀察鑒別，（不能稍有錯誤）。按預(yù)定的雜交組合，選取請本果蠅放入一個干凈干燥的空管內(nèi)，用棉塞塞好，并在試管外面貼上標(biāo)簽，寫明雜交組合形式（如殘翅雌性*+/+雄性），并注明母體及父體個數(shù)，等這些雜交親本已由麻醉狀態(tài)蘇醒，并能活躍飛動時，在再將這些果蠅傾入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)管內(nèi)，管上貼好標(biāo)簽，注明雜交組合形式，母體及父體個體數(shù)目，日期及試驗者姓名，進行雜交飼養(yǎng)。也可在雜交親本還處于麻醉狀態(tài)時，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)管內(nèi)，但須避免果蠅接觸管內(nèi)飼料或濕潤處，以免果蠅粘在這些地方

11、致死。因此可采取以下作法： 1）、將飼料管放在桌上，然后用紙條將親本果蠅放在培養(yǎng)管內(nèi)側(cè)壁上方，塞上棉塞，等果蠅活躍飛行時，再將培養(yǎng)管直立起來。2）、將仍處于麻醉狀態(tài)的國營（用作雜交親本）放在干凈的白紙上，再將培養(yǎng)瓶倒立，使培養(yǎng)瓶的口部嚴(yán)密罩著親本果蠅，等這些果蠅活躍飛行時，就自然飛入管內(nèi)，再將棉塞塞好。（注意千萬別寫錯或貼錯標(biāo)簽）2、將盛有雜交親本果蠅的培養(yǎng)管，放在適宜溫度處（2025），棉塞要塞好，切不要無故打開，以免雜菌傾入，若有生霉現(xiàn)象應(yīng)立即將果蠅換入新培養(yǎng)管內(nèi)。記錄第一個化蛹時間和第一個出蛹時間。3、78天后移出全部親本果蠅，記錄移出時間。4、待F1代成蠅孵出后，觀察其性狀并計數(shù)，每隔

12、23天觀察一次并作記錄，期間檢查35次，檢出的果蠅移去處理5、選取F1代果蠅5對移入新培養(yǎng)瓶內(nèi)互交繁殖（此時不一定用處女蠅，為什么？）每人作兩瓶，記錄第一個化蛹時間和出蛹時間。6、78天后移出全部F2果蠅，記錄移出時間。7、待F2代成蠅孵出后，觀察期性狀并記數(shù)，其檢查35次，檢出的果蠅移去處理。8、按下列格式記錄所得結(jié)果：（注意計數(shù)的準(zhǔn)確和觀察時的細(xì)致） A 雜交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F1，成蠅表現(xiàn)型及數(shù)目備注總數(shù)個人小組全班 B、F2互交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F2 成蠅表現(xiàn)型及數(shù)目備注表現(xiàn)型、數(shù)目表現(xiàn)型、數(shù)目總數(shù)個人小組全部9、用X2(卡平方)法測定實驗結(jié)果是否與理論價值相符。（根據(jù)

13、全班觀察統(tǒng)計總數(shù)進行）F2 表型野生型（+）殘翅（Vg）合計實驗觀察數(shù)（0）理論預(yù)期數(shù)3：1（e）差數(shù)（d）因為df=1，須進行連續(xù)性校正所以X 2=P=四、實驗報告內(nèi)容：1、簡述實驗過程。2、按實驗指導(dǎo)格式列出觀察和統(tǒng)計的實驗結(jié)果和X 2 檢驗結(jié)果。3、解釋說明所得結(jié)果，有無規(guī)律？有什么規(guī)律？4、在試驗技術(shù)和統(tǒng)計結(jié)果中有無發(fā)現(xiàn)什么問題？你對這些問題的看法（原因的分析）。實驗三：果蠅兩對相對性狀的遺傳分析自由組合定律的驗證 一、實驗?zāi)康模?驗證自由組合定律。二、實驗原理： 選取具有非同一連鎖群的兩對相對性狀的國營（如灰身長翅與檀黑身殘翅）雜交，F(xiàn)1代完全表現(xiàn)顯性性狀；F1代在形成配子時由于成對

14、因子的分離和非成對因子間自由組合造成F2代性狀分離。F1代配子分離比為1：1：1：1.F2代性狀分離比為：9：3：3：1。三、實驗材料用具及試劑： 灰身長翅純種處女蠅及檀黑身殘翅純種處女蠅。（其他同實驗二）四、實驗內(nèi)容及步驟：1、選取灰身長翅純種處女蠅及檀黑身殘翅雄蠅作為雜交親本，正反交，個培養(yǎng)一瓶，每瓶45對，記作P，進行雜交組合和是飼養(yǎng)。2、將盛有雜親本果蠅的培養(yǎng)管放在適宜溫度處（2025），進行飼養(yǎng)，記錄第一個化蛹時間和第一個出蛹時間3、78天移出全部親本，記錄移出時間。 4、待F1代成蠅孵出后，觀察其性狀并計數(shù)，每隔23天觀察一次并作記錄，期間檢查35次，檢出的果蠅移去處理5、選取F1

15、代果蠅5對移入新培養(yǎng)瓶內(nèi)互交繁殖（此時不一定用處女蠅，為什么？）每人作兩瓶，記錄第一個化蛹時間和出蛹時間。6、78天后移出全部F2果蠅，記錄移出時間。7、待F2代成蠅孵出后，觀察期性狀并記數(shù)，其檢查35次，檢出的果蠅移去處8、按下列格式記錄所得結(jié)果：（注意計數(shù)的準(zhǔn)確和觀察時的細(xì)致） A 雜交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F1，成蠅表現(xiàn)型及數(shù)目備注總數(shù)個人小組全班 B、F2互交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F2 成蠅表現(xiàn)型及數(shù)目總數(shù)個人小組全部9、用X2(卡平方)法測定實驗結(jié)果是否與理論價值相符。（根據(jù)全班觀察統(tǒng)計總數(shù)進行）F 表型合計實驗觀察數(shù)（0）理論預(yù)期數(shù)9：3:3：1（e）差數(shù)（d）X 2= P

16、=五、實驗報告內(nèi)容：1、簡述實驗過程。2、按實驗指導(dǎo)格式列出觀察和統(tǒng)計的實驗結(jié)果和X 2檢驗結(jié)果。3、解釋說明所得結(jié)果，有無規(guī)律？有什么規(guī)律？4、在試驗技術(shù)和統(tǒng)計結(jié)果中有無發(fā)現(xiàn)什么問題？你對這些問題的看法（原因的分析）。實驗四：伴性遺傳試驗實驗?zāi)康模毫私獍樾赃z傳與非伴性遺傳的差別，以及伴性基因遺傳在正反交中的差異實實驗原理：生物的性染色體根性別決定相關(guān)，性染色體上基因的遺傳方式與性別有關(guān)。伴性遺傳的主要特點是性狀的分離在兩性間部一致；正反交結(jié)果不一致。在一定的雜交組合下，F(xiàn)1代會出現(xiàn)隱性性狀實驗材料用具及試劑：紅眼（+）純種處女蠅和白眼（VV）白眼純種處女蠅（其他同實驗二）實驗內(nèi)容和步驟：1、

17、選取紅眼處女蠅與白眼處女蠅作為雜交親本，分別做正反交各一瓶，每瓶放45對。設(shè)：X+X+ XWY正交 XWXW X+Y反交）（方法同實驗二）.2、將盛有雜交親本果蠅的培養(yǎng)管放在適宜溫度處（2025），進行飼養(yǎng)，記錄第一個化蛹時間和第一個出蛹時間3、78天移出全部親本，記錄移出時間。 4、待F1代成蠅孵出后，觀察其性狀并計數(shù)，共檢查45次，檢出的果蠅移去處理5、將觀察統(tǒng)計結(jié)果填入下表：A:（正交）雜交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F1代表現(xiàn)型及數(shù)目備注紅眼白眼總計B:（反交）雜交組合 日期 試驗者統(tǒng)計日期F1代表現(xiàn)型及數(shù)目備注紅眼白眼紅眼白眼總數(shù)個人小組全班比例紅眼：白眼=根據(jù)全班總數(shù)得五、實驗報告內(nèi)

18、容：1、簡述實驗過程2、按格式列出觀察及統(tǒng)計的實驗結(jié)果。3、圖解實驗的果蠅正反交遺傳規(guī)律并加以解釋說明。4、在實驗技術(shù)和統(tǒng)計結(jié)果中有無發(fā)現(xiàn)問題？你對這些問題有何看法（原因分析）實驗五：西藏特色魚類染色體觀察與分析一、實驗?zāi)康模?掌握魚類染色體組型分析方法和步驟，掌握核型公式的分析方法，了解西藏特有魚類。二、實驗原理：染色體是遺傳信息的攜帶者，每一種特定的生物都含有特定的染色體，核型公式是分析生物染色體的有效工具。三、實驗材料用具及試劑：西藏特有魚類四、材料： 鑷子、手術(shù)剪刀、注射器、培養(yǎng)皿、吸管、解剖盤、酒精燈、載玻片、蓋玻片、燒杯。五、儀器： 顯微鏡、離心器（1000轉(zhuǎn)/分）、離心管、冰箱、

19、玻璃勻漿器。六、藥品：PHA、秋水仙素、魚類生理鹽水（淡水魚類是7.5 g/L，海水魚類是13.5 g/L）、0.075 mol/L KCl、固定液（甲醇、冰醋酸=3：11：1）、Giemsa染液、磷酸鹽緩沖液（PBS ，pH為6.8或7.4）、中性塑膠。七、步驟：1、取謝通門、拉薩河、尼羊河三個地區(qū)各30尾雌30尾雄健康黑斑原鮡暫養(yǎng)；2、然后將黑斑原鮡胸鰭基部注射PHA溶液，注射劑量為25g/g（魚體重），一次注射；3、 經(jīng)6小時后，再注射秋水仙素溶液，也是胸鰭基部一次注射，注射劑量和處理時間見實驗設(shè)計以及附表；4、斷尾放血，經(jīng)30分鐘后，解剖魚體，取出頭腎，用生理鹽水清洗頭腎，然后將頭腎置

20、于裝有適量生理鹽水的玻璃勻漿器中勻漿制成細(xì)胞懸液；5、低滲處理：然后將細(xì)胞液移入離心管中，離心5分鐘，棄去上清夜，加入少量低滲液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，然后加入適量的低滲液，處理40分鐘左右；6、預(yù)固定：低滲處理后，向低滲液中加入新配置的12ml固定液進行預(yù)固定，以防止低滲處理后的細(xì)胞在離心時結(jié)團。固定液要沿管壁緩緩加入，然后用吸管吹打混勻；7、第一次固定：預(yù)固定12分鐘后，離心去上清夜，然后向離心管中加入0.5ml的固定液，將細(xì)胞輕輕吹打細(xì)胞懸液后，加固定液25ml，混勻后固定2030分鐘；8、第二次固定：離心后去上清夜，加固定液25ml，混勻后固定2030分鐘；9、第三次固定：操作同前。第

21、三次固定后，經(jīng)離心后去掉大部分清夜，只留0.10.2ml固定液，混勻后即可滴片制作染色體。也可冷凍過夜，第二天離心，加少許固定液（甲醇：冰醋酸=1：21：1）混勻，然后加適量該固定液固定2030分鐘，離心5分鐘，去大部分清夜，混勻滴片制作染色體。視效果而定，建議用后一種方法；10、滴片：使用高純水制備的冰水片進行滴片（可增加滴片清晰度）。用吸管吸取細(xì)胞懸液，距滴片5cm左右距離滴片，每張載玻片滴13滴（根據(jù)懸液的濃度）。滴片后斜放，室溫干燥，亦可滴片后即刻用嘴輕輕吹片，可幫助細(xì)胞和染色體分散。亦可滴片后用酒精燈外焰干燥，視觀察效果而定；11、Giemsa染色：染液為1/10的Giemsa染液（

22、PBS：Giemsa原液=9：1），染色3060分鐘后，自來水沖洗，自然涼干； 12、組型分析：取100個圖象清淅、染色體分散較好的中期有絲分裂細(xì)胞，高倍鏡檢，確定染色體眾數(shù)，擇優(yōu)取30個細(xì)胞測量其染色體臂長，計算相對長度，臂比等，以Levan分類標(biāo)準(zhǔn)進行分類、配對，計算染色體臂數(shù)，得出核型公式。* 低滲處理是獲得分散良好的分裂相的關(guān)鍵步驟。過度與不足都會造成不好的影響。在低滲處理時細(xì)胞十分嬌嫩，并且表面發(fā)粘，如需混勻細(xì)胞懸液時，最好用吸管向低滲液中吹氣，以避免細(xì)胞破碎。在整個操作過程中，要注意不要將細(xì)胞吸到吸管上部，也不要接觸離心管的上部，否則將會丟失許多細(xì)胞。摸索低滲時間，建議延長低滲處理

23、時間至68個小時 ； 充分的固定是制備良好分散的染色體色重要步驟。如果染色體分散的不好，可在余下的細(xì)胞懸液中改為固定液（1：21：3），有時可改善由于低滲處理不夠或不充分所造成的缺陷。固定液要新配置，否則將會形成脂類，影響固定的效果。 滴片是制備染色體的最后一步，也是非常關(guān)鍵的一步，首先載玻片要非常干凈，否則將會影響染色體的分散和分帶的效果，建議對載玻片進行預(yù)處理，提前酒精消毒，冰水處理（玻片上應(yīng)有一層薄的冰霜）。分裂相過多或過少，染色體過于分散都會影響到分帶、染色效果和觀察；比較自然干燥法和酒精燈干燥的效果。 摸索染液處理時間，取效果好的時間段； 魚體標(biāo)記：標(biāo)記方法依具體情況而定，或剪須標(biāo)記

24、（須的位置、數(shù)量），或剪鰭標(biāo)記，或掛牌標(biāo)記，建議掛牌標(biāo)記； 制備好染色體片后，用二甲苯處理小時，目的是使染色體片清晰，然后用中性塑膠封片，用記號筆作標(biāo)記，以便回校觀察； 每次離心后應(yīng)盡可能的去掉上清夜，但又要注意不使細(xì)胞丟失；每次加液后用吸管吹打時，用力要均勻，也不要過猛，以能使細(xì)胞團散開為準(zhǔn)； 低滲時間過長，細(xì)胞膜過早破裂，造成染色體有丟失；如低滲處理不夠，細(xì)胞尚未脹開，則染色體往往分散不好，仍成團，不利于觀察計數(shù)分析。此外要注意低滲處理的溫度與時間，一般在室溫條件下處理，時間要長些，在37攝氏度，時間要短些。八、作業(yè)：1、為什么要進行低滲處理2、為什么要進行固定3、怎樣才能保持滴片干凈4、

25、對所研究藏魚進行染色體核型分析實驗六：西藏特色畜禽染色體觀察與分析一、實驗原理在骨髓細(xì)胞中，有絲分裂的指數(shù)是相當(dāng)高的，因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必像血淋巴細(xì)胞那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。通過活體注射秋水仙素，可以使部分細(xì)胞的分裂停止在中期，再經(jīng)過低滲、固定就可獲得大量的有絲分裂細(xì)胞。通過骨髓得到染色體是比較簡便的，一般也無需無菌操作。在實驗條件下，這種染色體是機體內(nèi)真實情況的反映。 直接制片法是直接從骨髓中取出細(xì)胞，經(jīng)壓片法或空氣干燥法制片。所謂空氣干燥法，實際上是將細(xì)胞經(jīng)過秋水仙素處理低滲處理充分的固定滴片等步驟之后在載玻片上得到染色體制片的技術(shù)。有時，有人把滴片的步驟叫做染色體分散，也有人把這一

26、步和隨后的干燥稱為空氣干燥法?！翱諝飧稍铩本褪堑纹螅患訜峄蛉魏翁幚?，使載片在室溫下自然干燥的方法。二、實驗材料、器具和試劑 出雛3日齡之內(nèi)的雛雞（按羽色自別配套）、顯微鏡、2毫升注射器、10毫升離心管、吸管、試管架、載玻片、恒溫水浴鍋、離心機、剪刀、解剖刀、蠟盤、。2ml注射器、5號針頭、10ml刻度離心管、吸管、試管、試管架、載玻片、蓋片、離心機、顯微鏡、解剖器具（剪刀、鑷子等）。 試劑：秋水仙素溶液（0.02%）、0.075MKCl、冰醋酸、甲醇、Giemsa母液。三、方法步驟1秋水仙素處理 取材前23h，給雛雞腹腔注射秋水仙素溶液，劑量為24微克克活重。2殺雞取髓 用斷頸椎方法處死雛

27、雞，取出脛骨和股骨，剔凈皮肉，用自來水將肌肉碎渣沖洗干凈。用剪刀剪掉脛骨和股骨兩端，用2毫升注射器吸取等滲液2%檸檬酸鈉溶液通過5號針頭注入骨髓腔反復(fù)4-5次將骨髓細(xì)胞沖入離心管。共收集細(xì)胞懸液56毫升。平衡，1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，棄上清。3低滲 向試管內(nèi)加預(yù)熱的0.075MKCl溶液，置37恒溫水浴鍋內(nèi)低滲2021分鐘。4預(yù)固定 低滲結(jié)束時，加入3-5滴新配甲醇-冰醋酸固定液，立即混勻，平衡，1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，棄上清。5第一次固定 加入新配甲醇-冰醋酸固定液5-6毫升，用吸管輕輕吸打均勻，靜置20分鐘。1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，棄上清。6第二次固定 加入新配甲醇-冰醋酸固定液5-

28、6毫升，用吸管輕輕吸打均勻，靜置20分鐘。1000轉(zhuǎn)/分離心8-10分鐘，棄上清。7滴片 加入適量（46滴）固定液制成細(xì)胞懸液，滴兩滴于冰凍的載玻片上，空氣干燥。 8將染色體制片反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀釋液染色30分鐘，自來水沖洗，干后，顯微鏡下觀察。四、作業(yè)1、為什么要選取骨髓作為畜禽染色體分析材料2、分析所研究畜禽的染色體核型公式實驗七 果蠅唾腺染色體標(biāo)本制備和觀察一、實驗?zāi)康暮鸵?了解3齡幼蟲的飼養(yǎng)特點2熟練取出黒腹果蠅的唾腺3掌握壓片法制備果蠅唾腺染色體4要求參加實驗的學(xué)生認(rèn)真預(yù)習(xí)實驗指導(dǎo)，認(rèn)真閱讀參考資料。事先了解實驗原理、材料和方法以及實驗步驟。二、實驗分組一個班約

29、30人不分組人人都做該實驗。三、實驗材料、器具和試劑 材料：黑腹果蠅三齡幼蟲，選擇遲緩、肥大，爬上管壁的3齡幼蟲最佳。器材：顯微鏡、解剖鏡、解剖針、載玻片、蓋玻片、試劑：生理鹽水（0.7%NaCl）、5%的醋酸洋紅（或石炭酸）、濾紙片。松香石蠟：用等量的松香和52石蠟放在蒸發(fā)皿內(nèi)用小火煮（大火會燒起來），待兩者充分混合成濃的米黃色，取下來冷卻凝固。使用時，用燒熱鐵絲的前端沾有少量的溶解物，封在載玻片周圍。四、方法步驟1三齡幼蟲的飼養(yǎng) 專供果蠅唾腺染色體壓片的幼蟲必須十分肥大，發(fā)育良好的唾液腺在解剖鏡下面可以清楚地看到為數(shù)不多的較大的腺體細(xì)胞，取其染色后壓片，可望獲得理想的唾腺染色體。2從培養(yǎng)基

30、中挑選一只肥大的三齡幼蟲。3將幼蟲放在載玻片上，加上一小滴生理鹽水，置于解剖鏡下。4兩手各執(zhí)一支解剖針，一支固定在幼蟲軀干部（身體末端1/3處），另一支固定在頭部（口器的后部），用力向前拉，把頭部自身體拉開，唾腺即隨之而出。唾腺為一對透明狀的長圓物體(圖3-4)。圖3-4 果蠅唾腺a肛門，h后腸，g盲囊，mi中腸，i唾腺原基，mh大腺溝，o食道，ph咽頭，pr前胃，sd唾腺分泌管，sq唾腺，mt馬氏管5仔細(xì)將唾腺與其他組織分離（如脂肪組織和拉斷的消化道部分）待分離后用濾紙擦去其他組織。（注意勿使唾腺干燥）。6滴兩滴醋酸洋紅染液，染色2030分鐘。7用濾紙吸去多余的染液，重新加入一小滴染液。加上

31、蓋片。8用大拇指在蓋玻片上用力壓，以使唾腺細(xì)胞中的染色體破核而出。9置顯微鏡下觀察。10好的片子用松香石蠟封片。另一種封片是用加拿大膠，即將上述壓片放在95%的酒精蒸汽中固定24h后，再放在95%的酒精中輕輕取下蓋片，稍擦凈后滴一滴封片用的加拿大膠，蓋上一片干凈的蓋片即制成永久片。11果蠅唾腺染色體標(biāo)本觀察 先在低倍鏡觀察片子，找到好的染色體圖象后，放到視野中心，再用高倍鏡觀察。黑腹果蠅的唾腺染色體是2n=24=8。但因短小的第4染色體和X染色體的著絲粒在端部，所以染色體的一端在染色中心上，看上去，各自只形成一條線狀和點狀的染色體。只有第二和第三染色體的著絲粒在中央，它們從染色中心以V字形向外

32、伸出（圖3-5）。 圖3-5 果蠅唾腺染色體模式圖五、作業(yè)1何謂果蠅的三齡幼蟲？2你是否順利取到果蠅唾腺？有什么體會？畫出果蠅唾腺示意圖。3為什么說果蠅唾腺染色體是多線染色體？4為什么說果蠅唾腺染色體是研究染色體畸變最好的實驗材料？附：參考資料：果蠅唾腺染色體的特殊性上世紀(jì)初，D.Kostoff用壓片法首先在D.melanogaster果蠅幼蟲的唾腺細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了特別巨大的染色體唾腺染色體（salivary gland chromosomes），這種染色體寬約5微米，長約400微米，相當(dāng)于普通染色體的100150倍，由于它具有許多重要特點而成為細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進化遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)研究

33、不可多得的好材料。唾腺染色體經(jīng)過多次復(fù)制而并不分開，大約有10004000根染色體絲的拷貝，所以又稱為多線染色體。多線染色體經(jīng)過染色后，出現(xiàn)深淺不同，密疏各別的橫紋，這些橫紋的數(shù)目和位置往往是恒定的，代表著果蠅等昆蟲的種的特征。如染色體有缺失、重復(fù)、倒位、易位等，很容易在唾腺染色體上識別出來。雙翅目昆蟲的整個消化道細(xì)胞（從唾腺直到直腸）發(fā)育到一定階段之后就不再進行有絲分裂，停止在間期。但隨著幼蟲整體器官以及這些細(xì)胞本身體積的增大，細(xì)胞核的染色體，尤其是唾腺染色體仍不斷地進行自我復(fù)制而并不分開。據(jù)估計，大約有10004000條染色絲的拷貝形成一束巨大染色體，因此，唾腺染色體又稱為多線染色體。由于

34、唾腺細(xì)胞在果蠅的幼蟲時期永遠(yuǎn)處于分裂的間期狀態(tài)，所以每一條核蛋白絲都處于伸展?fàn)顟B(tài)，因而它不同于其他細(xì)胞分裂中期時的高度螺旋化的染色體。實驗八：核酸的瓊脂糖凝膠電泳一、試劑及配方:0.5M EDTA：EDTA 93.06 g，加蒸餾水溶解，至500ml，用NaOH調(diào)pH值至8.0。5TBE緩沖液：Tris堿54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA（PH=8.0）20ml，加水至1000mL。30% PAGE：丙烯酰胺290g，甲叉丙烯酰胺10g，加去離子水溶解，定容至1000ml，4保存10%過硫酸銨：過硫酸銨10g，加去離子水溶解定容100ml，4保存，在30天內(nèi)使用。TEMED：4保存。0

35、.1 AgNO3：取0.5 g AgNO3（由于配的是500ml的故0.1500/1000.5g），加去離子水至500ml溶解。顯色液（3% NaOH）：取15g NaOH，加去離子水至500ml溶解，加0.076g四硼酸鈉和800ul甲醛。二、操作過程:12%非變性聚丙烯胺凝膠（25ml體積，0.1厘米膠條）制作及電泳：清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，晾干后上墊條,用夾子夾好.（2）在100ml燒杯內(nèi)加入30%丙烯酰胺10.0ml，2.5ml 50%的甘油，5 ml5TBE 5ml，10%過硫酸銨0.175ml，TEMED 8l，加入純水7.325ml，混合后迅速灌膠；此為一塊膠的量，

36、多塊膠時按比列加倍.（3）當(dāng)灌膠至玻璃板上沿0.1cm是停止灌膠，插入梳子，室溫聚合半小時，多余的丙烯烯胺保存。隨時觀察凝膠聚合情況，并補加丙烯烯胺；（4）凝膠聚合好后，向電泳槽加入1TBE（可用5TBE100 ml定容到500即可），用注射器沖洗加樣空；（5）預(yù)電泳10分鐘，同時準(zhǔn)備點樣；（6）取1lPCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5l變性Buffer，離心混勻.98度變性10分鐘；（一般的PAEG膠不需要此步驟）（7）迅速冰浴10分鐘，用微量注射器點樣；（一般的PAEG膠不需要此步驟）（8）打開電源，150伏電泳14-16小時。硝酸銀染色方法：用去離子水沖洗膠；用0.1 AgNO3 染色液染色

37、3040min；去離子水沖洗2遍；用3 NaOH顯色液（每500ml顯色液中加0.076g四硼酸鈉、800ul甲醛）顯色1020分鐘；用去離子水沖洗多余的顯色液保鮮膜封好，觀察和照相三、經(jīng)驗和注意事項:(1)沖洗玻璃板用自來水即可，不必用去離子水或蒸餾水；(2)玻璃板及其它器物要及時清理，不然當(dāng)膠凝固后很不好清洗；(3)梳子和墊條要搭配好，不要用較薄的梳子配較厚的墊條，這會導(dǎo)致許多碎膠，不易沖洗干凈點樣孔，影響點樣；(4)剛烘干的玻璃板如溫度較高應(yīng)在冷卻后再注膠，不然，顯色后會有水印；(4)如顯色后條帶較淺，可能是由于染色時溫度較低，可通過加熱水和染、顯色溶液而得到改善，但不易太熱（如高于35

38、度），這會加深膠的背景。實驗九：PCR技術(shù)與分析 基因擴增技術(shù)（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新?？蓪O微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細(xì)胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。PCR技術(shù)是由Cet

39、us公司和加利福利亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫(yī)院得到推廣

40、。我們通過老師的演示試驗，要求學(xué)生們掌握以下的基本理論與基本技能的學(xué)習(xí)：一、PCR的基本原理和基本程序PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5到3方向?qū)⒁镅由?、自動合成新的DNA鏈、使

41、DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開引物退火復(fù)性在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴增。二、PCR的特點 （一）特異性高：首次報導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是

42、在37延伸（聚合）易產(chǎn)生模板引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。 （二）高度敏

43、感：理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴增DNA十億倍以上，實際應(yīng)用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。 （三）快速及無放射性：一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，

44、無放射性易于推廣。 （四）簡便：擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點的載體中。 （五）可擴增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片

45、段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。三、PCR方法（一）試劑（1）引物：決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90-100。 (3)10PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10PCR緩沖液隨酶一起購買。（4）5mmol/L dNTP貯備液：將

46、dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300l，-20保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。（5）DNA模板：用處理液將待測標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測的DNA。（二）操作程序 過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：（1）向一微量離心管中依次加入DNA模板 102-105拷貝引物 各1mol/LdNTP 各200mol/L10PCR緩沖液1/10體積ddH2O補到終體積

47、（終體積50l-100l）混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25l，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。（2）加石蠟油50-100l于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97變性10min。（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。（4）PCR的循環(huán)程序為：94變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72溫育5min，以確保充分延伸。P

48、CR尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500l的Eppendorf管內(nèi)。加入400l二甲苯脫脂，離心除

49、去二甲苯，用400l 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100lPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進行DNA擴增。在應(yīng)用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。四、PCR反應(yīng)的基本條件及其對PCR的影響（一）模板核酸 PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行PCR循環(huán)。不同來源

50、的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴增，處理不當(dāng)或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴增失敗。（二）引物 PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當(dāng)數(shù)量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴增和信號強度的降低。因此

51、，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20保存。PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.21mol/L為宜，但我們實驗發(fā)現(xiàn)，最適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此濃度。（三）緩沖液 PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。目前最

52、為常用的緩沖體系為10-50mmol/LTris-HCl (pH8.3-8.8,20) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20時其pKa值為8.3，pKa值為-0.021/。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20)在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產(chǎn)量。反應(yīng)混合液中50mmol/L以內(nèi)的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應(yīng)中加入

53、小牛血清白蛋白（100g/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%）有助于酶的穩(wěn)定，反應(yīng)中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護劑對PCR反應(yīng)是有利的。（四）Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。（五）三磷酸脫氧核苷酸（dNTP） 四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dN