實(shí)驗(yàn)二+微量凱氏定氮法測(cè)定總氮量

1、實(shí)驗(yàn)二 總氮量的測(cè)定凱氏定氮法 一 目的：學(xué)習(xí)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作技術(shù)二 原理：通過(guò)含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱生成硫酸銨，后與濃堿反應(yīng)產(chǎn)生氨經(jīng)硼酸吸收后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī) 酸滴定即可測(cè)出待測(cè)物中的總氮量三 試劑：濃硫酸（化學(xué)純）、粉末硫酸鉀硫酸銅混合物、NaOH、硼酸、鹽酸、田氏指示劑（甲烯藍(lán)乙醇與甲基紅乙醇混合）、面粉四 器材：凱氏定氮燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分析天平、烘箱、電爐、100ml蒸餾燒瓶、小玻璃珠五 操作步驟六 實(shí)驗(yàn)報(bào)告1二、原理生物材料的含氮量測(cè)定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，蛋白質(zhì)的含氮量約為16，測(cè)出含氮量則可推知蛋白含量。消化：有機(jī)

2、物與濃硫酸供熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮硫酸銨。為加快反應(yīng)，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。 甘氨酸的消化過(guò)程可表示如下： CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)(相當(dāng)于待測(cè)物中氨的摩爾數(shù))計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。本法適用于0.2 2.0 mg的氮量測(cè)定。2三、試劑1、濃硫酸

3、 200mL 2、粉末硫酸鉀硫酸銅混合物 16g K2S04與CuS04.5H20以 3：1配比研磨混合3、30氫氧化鈉溶液 1 000 mL 4、2硼酸溶液 5 000 mL5、標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(約001 molL)6、混合指示劑(田氏指示劑) 由50mL01甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL01甲基紅乙l醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。這種指示劑酸性時(shí)為紫紅色，堿性時(shí)為綠色。變色范圍很窄且靈敏。7、市售標(biāo)準(zhǔn)面粉和富強(qiáng)粉各2g 3五、操作方法1.樣品處理 原因: 某一固體樣品中的含氮量是用100g該物質(zhì)(干重)中所含氮的g數(shù)來(lái)表示()。方法:一般樣品烘干的溫度都采用105，因?yàn)榉怯坞x的水都不能在100

4、以下烘干。在稱(chēng)量瓶中稱(chēng)一定量磨細(xì)的樣品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于105的烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)。用坩堝鉗將稱(chēng)量瓶放人干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱(chēng)重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時(shí)后，稱(chēng)重一次，直到兩次稱(chēng)量數(shù)值不變，即達(dá)恒重。若樣品為液體(如血清等)，可取一定體積樣品直接消化測(cè)定。42消化取4個(gè)100mL凱氏燒瓶 標(biāo)號(hào)。各加l顆玻璃珠，在1及2號(hào)瓶中各加樣品0.1g，催化劑(K2S04CuS04?5H2O)200 mg，消化液5 mL。在3及4號(hào)瓶中各加0，1 mL蒸餾水和與1及2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照，用以測(cè)定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。每個(gè)瓶口放漏斗，在通風(fēng)櫥內(nèi)的電

5、爐上消化。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。 當(dāng)消化開(kāi)始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開(kāi)始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。 定容：冷卻后，加蒸餾水約10 mL。(注意慢加，隨加隨搖)。然后將瓶中溶物傾人50 mL的容量瓶中，并以蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，將洗液并容量瓶，用水稀釋到刻度，混勻備用。5改進(jìn)型凱氏定氮儀結(jié)構(gòu)6 特點(diǎn)：將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器和冷凝器組成一個(gè)整體，體積小，安裝容易，操作簡(jiǎn)便。 (1)水蒸汽發(fā)生器和反應(yīng)室 (2)冷凝器和通氣室(3)排水柱關(guān)鍵:搞清水管系統(tǒng)7蒸餾器的洗滌 接通冷凝水，先向蒸汽發(fā)生器中

6、加入一定量的水(先關(guān)閉進(jìn)水口,再關(guān)閉出水口,以排水口高度為宜),用酒精燈將其加熱燒開(kāi)。水的自動(dòng)噴出：將蒸餾水由加樣室加入反應(yīng)室，將酒精燈移開(kāi)片刻，打開(kāi)自由夾，使冷水進(jìn)入蒸汽發(fā)生器，如此反復(fù)清洗3-5次。清洗后在冷凝管下端放一錐形瓶盛有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示劑的混合液。如不變色則表明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。 83蒸餾過(guò)程：準(zhǔn)備:取50 mL錐形瓶數(shù)個(gè)，各加入5 mL 2硼 酸溶液和12滴指示劑，溶液呈淡紫色，用表面皿覆蓋備用。關(guān)閉冷凝水，打開(kāi)自由夾，使蒸汽發(fā)生器與大氣相通。將一個(gè)盛有硼酸和指示劑溶液的錐形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸沒(méi)在液體內(nèi)。加樣:用移液管取5 mL消化液，細(xì)心地

7、加入反應(yīng)室，隨后加入30NaOH溶液5mL，關(guān)閉自由夾，在加樣漏斗中加少量水做水封。蒸餾:關(guān)閉自由夾,打開(kāi)冷凝水(注意不要過(guò)快過(guò)猛，以免水溢出)。點(diǎn)燃酒精燈,蒸餾開(kāi)始,當(dāng)觀(guān)察到錐形瓶中的溶液由紫變綠時(shí)(約23分鐘)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，蒸餾3分鐘，移開(kāi)錐形瓶，使冷凝器下端離開(kāi)液面約1cm，同時(shí)用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外側(cè)，繼續(xù)蒸餾1分鐘，取下錐形瓶，用表面皿覆蓋瓶口。蒸餾完畢后，應(yīng)立即清洗反應(yīng)室，方法如前所述。 如此35次。最后將自由夾同時(shí)打開(kāi)，將蒸汽發(fā)生器內(nèi)的全部廢水換掉，繼續(xù)下一次蒸餾。待樣品和空白消化液均蒸餾完畢，同時(shí)進(jìn)行滴定。94.滴定全部蒸餾完畢后，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色為滴定終點(diǎn)。 105.計(jì)算總氮量=C(V1-V2)0.014/w 消化液量(ml) / 滴定消耗用液量(ml)c為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度；V1為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；V2為滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)w為樣品重量(g)。14為氮的相對(duì)量子質(zhì)量。若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)，則，樣品中蛋白質(zhì)含量