藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析課件

1、II -免疫分析法Immunoassays抗體 -生物體自造的“magic bullet”醫(yī) 療直接或與毒素連結(jié)攻擊 病變細(xì)胞研 究各種免疫分析抗體藥物銷售趨勢圖國際抗體藥物2009年美國市場上的抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷售額最大的類別。2010年美國市場的單抗藥物銷售額為185億美元2011年，全球單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到628億美元，世界范圍內(nèi)的單抗藥物銷份額約是整個生物制藥市場份額的36%。國內(nèi)抗體藥物目前我國的上市抗體品種中,國外進(jìn)口單抗占據(jù)多數(shù)2011年國內(nèi)市場規(guī)模超過10億元我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素：動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個國家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的核心競爭點抗體下游純

2、化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩QbD（質(zhì)量源于設(shè)計）理念的應(yīng)用Antibody and structure特點：2個基因決定一個蛋白質(zhì) 與抗原的結(jié)合力強，高度專一性抗原和抗原決定簇一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定簇每個 抗原決定簇至少誘生一種專一性抗體蛋白質(zhì)抗原的決定簇含有六個以上氨基酸 。 克隆選擇學(xué)說單抗和多抗多克隆抗體（polyclonal antibody）指由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的針對多種抗原決定簇的多種抗體混合物，如免疫血清。單克隆抗體（ monoclonal antibody）指由一種 B 細(xì)胞生產(chǎn)，針對某一抗原決定簇的單一抗體。Preparation of pol

3、yclonal antibodies傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫混合抗體123412341234免疫前要先把抗原作成乳劑約在兩月內(nèi)注射五到八次Preparation of monoclonal antibodiesPreparation of recombinant antibodies淋巴細(xì)胞總RNA抗體輕、重鏈文庫重組單鏈抗體基因輕、重單鏈基因大腸桿菌表達(dá)體系單鏈抗體單鏈抗體在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽，連成一條單鏈如果僅是兩條鏈的可變區(qū)，稱為ScFv連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是GGGGS3Ab as antige

4、n- Primary and secondary antibodyPrimary AbSecondary AbPrimary AbProtein A二抗針對一抗的物種特異性Protein A針對所有動物抗體FcImmunoassaysThe most important biological assays for:Identification of proteins and small bio-moleculesQuantification for complex biological sample without separationPowerful separationHigh sensi

5、tivity, specificity and accuracy 抗體的標(biāo)記方法放射性同位素標(biāo)記酶標(biāo)記熒光標(biāo)記有機分子熒光標(biāo)記綠色熒光蛋白標(biāo)記稀土熒光標(biāo)記通用標(biāo)記放射性碘標(biāo)記HRP酶標(biāo)記簡單化學(xué)偶聯(lián)方法： 1過碘酸鈉法：僅用于HRP的標(biāo)記。HRP是一種糖蛋白，過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，再與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)后，再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后，形成穩(wěn)定的HRPCH2NHIgG酶標(biāo)記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，常在標(biāo)記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上的和氨基。 2戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法：戊二醛具有兩個活性醛基，分別與酶分子和抗體分子上的氨基結(jié)

6、合。 NaHB4HRPLabeling with isoFITCGFP labelingGFP geneScFv geneVectorexpressionGFP geneProtein A geneVectorexpressionAb-Fc通用標(biāo)記+Avidin/streptA+Anti-digoxin Ab 2nd AbProtein APrimary AbPrimary AbImportant assaysImmunostainingWestern blotFluorescent microscopyQuantification of immunostainingQuantitative

7、assays: Radioimmunoassay, RIAcompetent bindingFluorescence immunoassay, FIAFPIA-homogeneous assayTRFIAEnzyme-linked immunosorbent assay, ELISAImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞單層細(xì)胞/組織固定免疫染色（熒光）顯微鏡觀察免疫熒光標(biāo)記的c-Myc phalloidin熒光標(biāo)記的微絲 熒光染色的細(xì)胞核 合成圖像 Immunoblot - Western BlotElec

8、troblottinggelPVDF membraneImmunostaining封閉分析抗體顯色抗體顯色數(shù)字化灰度圖像分析0.5 1 2 4 6 8 12 16 24 30 (h)c-mycp53Cyclin D1ActinCaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotinRIA Assay免疫競爭結(jié)合分析-小分子抗原分析的基本方法Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag*AgAb: Precipitant放射性計數(shù)常用分離沉淀技術(shù)鹽析法：飽和硫酸銨、硫酸鈉聚乙二醇法（w=6000）特點： 快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大抗體免疫沉淀法特點

9、： 分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價高，但成本高固相吸附劑RIA測量步驟恒量的* Ag、Ab加入反應(yīng)管中加入待測樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）37或4 溫育加入分離劑分離結(jié)合及游離部分測定以總放射性為分母，測定* AgAb 為分子，計算結(jié)合%，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度Calibration curveELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）Sandwich ELISA競爭法（略）High ConvenienceHigh Sensitivity96-well plate包被封閉結(jié)合顯色酶標(biāo)儀測定hv

10、洗滌洗滌洗滌終止酶的底物 鄰苯二胺(OPD) + H2O2 TMB ABTSHRP的底物氧化產(chǎn)物(橙紅色)492nm吸收2mol/L硫酸終止反應(yīng)AP的底物 硝基苯磷酸酯 對硝基酚(黃色) NaOH終止反應(yīng) 405nm吸收峰磷酸4-甲基傘酮（熒光底物）熒光偏振免疫分析Principle of fluorescence polarization emittingdipoleabsorbingdipoleexcitation light polarized along zxzyIIdetectorFluorescence polarization immunoassayAg + Ab AgAb +

11、Ag + * Ag * AgAb + * Ag High polarized fluorescenceLow polarized fluorescence偏振度r時間分辨熒光免疫分析熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0熒光背景和常用探針分子的熒光壽命Lanthanide labelingLanthanide labelin

12、gLigand labelingCTTABCPDA鑭系熒光底物法DELFIA法熒光試劑標(biāo)記可以消除環(huán)境中稀土污染造成的熒光背景固相時間分辨熒光分子印跡和核酸適配體思考題什么是抗體？其結(jié)構(gòu)特征是什么？怎么由基因編碼一個抗體？什么是抗原決定簇？一個抗原分子是否只有一個抗原決定簇？抗體與抗原結(jié)合的特異性如何？為何有如此高的特異性？抗體有哪些應(yīng)用？什么是抗體的Fab片段和Fc片段？其結(jié)構(gòu)分別是如何？什么是單抗和多抗？分別是如何制備的？哪一種抗體的特異性高？為什么？什么是抗體庫？什么是單鏈抗體？什么是ScFv？如何制備單鏈抗體？單鏈抗體有何應(yīng)用？什么是二抗？二抗與一抗如何結(jié)合的？如何選擇使用二抗？ 什么是Protein A？它如何與抗體結(jié)合的？什么是免疫分析？免疫分析有哪些特點？有哪些主要類型的免疫分析？抗體標(biāo)記有哪些種類和方法