用于基因克隆載體

1、關(guān)于用于基因克隆的載體第一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二章 分子克隆單元操作2.2 2.3 2.1 用于基因克隆的載體DNA的體外重組（切與接）目的基因的克隆2.4 轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢）2.5 第二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程基本流程第三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 用于基因克隆的載體質(zhì)粒載體噬菌體或病毒載體考斯質(zhì)粒與噬菌粒人工染色體載體載體的基本概念第四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、載體的基本概念載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增

2、或表達(dá)的工具。載體的主要功能：運(yùn)載：高效運(yùn)載外源基因至受體細(xì)胞內(nèi)維持：自主復(fù)制或整合至宿主基因組，以達(dá)傳代目的擴(kuò)增：使外源基因拷貝數(shù)增加（克隆載體）表達(dá)：為目的基因表達(dá)提供順式元件（表達(dá)載體）第五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、載體應(yīng)具備的條件可轉(zhuǎn)移性：具有針對受體細(xì)胞的“親緣性”或“親和性” 可篩選性：具有合適的篩選標(biāo)記 具有一定的裝載能力：在插入外源基因后仍能有效轉(zhuǎn)化宿主基因文庫構(gòu)建需要非常大的容量方便外源基因克?。壕哂卸喾N單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點 (或多克隆位點 )可傳代性：具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點 第六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年

3、6月第七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、載體類型克隆載體（cloning vector）主要用于在大腸桿菌細(xì)胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建基因文庫。表達(dá)載體（expression vector)除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達(dá)用的啟動子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達(dá)目的基因。1）按功能分主要有：第八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、載體類型自主復(fù)制型載體含復(fù)制子，可獨立于宿主染色體外復(fù)制與傳代。 穿梭載體裝有針對兩種不同受體的復(fù)制起點，便于基因克隆整合型載體不含復(fù)制子，需借助同源重組機(jī)制整合于宿主基因組。2）按傳代特性

4、分：第九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-牛乳頭瘤病毒迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌-植物細(xì)胞穿梭載體。第十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、載體類型質(zhì)粒（Plasmid)噬菌體（bacteriophage)/病毒(virus)考斯質(zhì)粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid）人工染色體（YAC，BAC）3）按來源分：第十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒載體的特點與類型幾個

5、重要的質(zhì)粒載體質(zhì)粒的制備與鑒定天然質(zhì)粒 質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題第十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒：是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于宿主染色體而自主復(fù)制、并能穩(wěn)定遺傳的一類DNA分子。*質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中*絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalently closed circular DNA)*質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 200 kb大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（F因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）第十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒是獨立

6、的復(fù)制子（replicon）：含復(fù)制起始位點（origin, ori )和控制復(fù)制頻率的調(diào)控基因 能利用宿主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制( ori )為與宿主穩(wěn)定地共存并把代謝負(fù)擔(dān)減至最低, 質(zhì)粒必須控制自身的復(fù)制。在一定的生長條件下、在一定的宿主菌中, 某一質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常是一定的。第十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的復(fù)制是由固定的起始點開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。一個復(fù)制子只含一個復(fù)制起點。細(xì)菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個復(fù)制子完成復(fù)制的，而真核生物基因組可以同時在多個復(fù)制起點上進(jìn)行雙向復(fù)制，也就是說它們的基因組包含有

7、多個復(fù)制子。第十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控：調(diào)控區(qū)緊鄰ori，方便構(gòu)建調(diào)控區(qū)編碼RNAI（反義）和Rop蛋白，抑制復(fù)制引物RNAII與模板結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNA II（引物）RNA I355363個氨基酸,提高RNAI的抑制缺失會 如何？第十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月調(diào)控區(qū)編碼抑制蛋白Cop，控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep起始因子抑制蛋白質(zhì)如何通過質(zhì)粒改造提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)？第十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2

8、022年6月根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控的嚴(yán)密程度，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒： 1 - 5 拷貝，如pSC101松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒： 30 - 50 拷貝，如 ColE1氯霉素擴(kuò)增：在宿主菌生長的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成、關(guān)閉主要代謝途徑，以使松弛型質(zhì)粒 迅速大量擴(kuò)增（可達(dá)上千拷貝）的操作。第十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性：在沒有選擇壓力的情況下，任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細(xì)胞中的現(xiàn)象。不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p

9、SC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第二十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，可導(dǎo)致子代細(xì)胞質(zhì)粒組成不同，且這種差異具隨機(jī)性，經(jīng)過若干代后宿主細(xì)胞中處于數(shù)量弱勢的質(zhì)粒必然被淘汰，而僅剩強(qiáng)勢質(zhì)粒。第二十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個

10、細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F、部分Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom 和mob 基因決定第二十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得宿主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成 細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選

11、具有重要意義第二十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月天然質(zhì)粒的改造野生型質(zhì)粒的缺點： 分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標(biāo)記不理想改造策略：去掉復(fù)制和維持非必須序列；失活復(fù)制負(fù)調(diào)控序列；引入多克隆位點；引入理想的篩選標(biāo)記基因pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 TcrColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr野生質(zhì)粒第二十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇性標(biāo)記：供重組子篩選用的遺傳標(biāo)記基因 多克隆位點（MCS）一段短的DNA 序列，

12、含有多種單一限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，是外源基因插入的位點。（二）質(zhì)粒載體的特點與類型質(zhì)粒載體關(guān)鍵元件：復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點復(fù)制起點：供自主復(fù)制用的由復(fù)制起始位點和調(diào)控基因組成的短序列第二十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒載體的特點：分子量小，便于操作易于構(gòu)建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架用途廣泛缺點：裝載量小（小于10kb），不能用來克隆大片段第二十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）質(zhì)粒載體的類型人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC10

13、1 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列整合質(zhì)粒 裝有促進(jìn)整合的基因，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選第二十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 1、pBR322： 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50 - 100 / cell用于基因克隆 用自己所學(xué)的知識分析該質(zhì)粒有何優(yōu)缺點？第三十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月pBR3

14、22質(zhì)粒載體的優(yōu)點： 1、具有較小的分子量； 它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr 基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增之后每個細(xì)胞中可積累10003000個拷貝。 第三十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Am

15、p平板Tet平板第三十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 pBR322質(zhì)粒載體的改良 為了更加實用，人們對pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點。第三十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 PUC質(zhì)粒：人們在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5-端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。 第三十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、pUC18 / 19：最優(yōu)秀的常規(guī)克隆載體 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序，T載體的母載體 裝有多克隆位點

16、（MCS）含AP和正選擇顏色標(biāo)記 lacZ第三十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個部分： 1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）； 2、氨芐青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點。 3、大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ）的啟動子及編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ基因； 4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第三十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lac

17、Z 的顯色原理（互補(bǔ)）pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第三十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點；在操作過程中復(fù)制起點內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細(xì)胞500700個拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測重組體； 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-

18、 互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對重組子進(jìn)行鑒定。 第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第四十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、T載體：克隆PCR產(chǎn)物用多克隆位點中某處線性化，加裝堿基T，以便和PCR產(chǎn)物的A互補(bǔ)。pMD18-T？第四十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月MCS第四十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月T-vector兩條鏈的3端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3端多加一個AT-A克隆第四十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6

19、月第四十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、pGEM：多拷貝裝有兩個噬菌體的強(qiáng)啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6E.coli BL21（DE3）等第四十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第一次課所授重點內(nèi)容的回顧第四十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二章 分子克隆單元操作2.2 2.3 2.1 用于基因克隆的載體DNA

20、的體外重組（切與接）目的基因的克隆2.4 轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢）2.5 第四十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 用于基因克隆的載體質(zhì)粒載體噬菌體或病毒載體考斯質(zhì)粒與噬菌粒人工染色體載體載體的基本概念第四十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、載體的基本概念載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增或表達(dá)的工具。2、載體應(yīng)具備的條件1、載體的主要功能3、載體的類型（重點） 1）按功能分；2）按傳代特性分；3）按來源分穿梭載體有什么作用？第五十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、質(zhì)粒(

21、plasmid)質(zhì)粒的生物學(xué)特性（幾個基本概念）嚴(yán)緊型/松弛型；不相容性；氯霉素擴(kuò)增質(zhì)粒載體的特點與類型（關(guān)鍵元件、特點）重要的質(zhì)粒載體（pBR322；pUC18/19；T載體）第五十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇性標(biāo)記：供轉(zhuǎn)化子/重組子篩選用的遺傳標(biāo)記基因 多克隆位點（MCS）供外源基因插入的、由單一切點內(nèi)切酶識別位點組成的序列質(zhì)粒載體關(guān)鍵元件：復(fù)制位點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點復(fù)制位點：供自主復(fù)制用的由復(fù)制起始位點和調(diào)控基因組成的短序列第五十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 1、pBR322： 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50

22、- 100 / cell用于基因克隆 第五十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、pUC18 / 19：最優(yōu)秀的常規(guī)克隆載體 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序，T載體的母載體 裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ第五十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月本次課內(nèi)容 第五十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）質(zhì)粒DNA的制備與鑒定實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿裂解法 質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法 質(zhì)粒DNA純度、操

23、作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間第五十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月氯化銫密度梯度離心法： 對質(zhì)粒的構(gòu)象要求較高時采用用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第五十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月堿裂解法： 最常用用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DN

24、A及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA cccDNAL-DNAocDNA第五十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA第六十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第六十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素（1）寄主菌株的遺傳背景一般建議使用en

25、dA基因發(fā)生突變的大腸桿菌寄主菌株，例如DH5、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突變的結(jié)果，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，從而增進(jìn)了所含有的質(zhì)粒DNA分子的穩(wěn)定性。所以從這類寄主細(xì)胞中制備的質(zhì)粒DNA不僅在質(zhì)量上有所改進(jìn)，同時在產(chǎn)量上也得到了提高。（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小質(zhì)粒分子拷貝數(shù)的多寡和質(zhì)粒分子大小是決定其DNA產(chǎn)量的重要因素之一。第六十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性問題一、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，有的細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒 DN拷貝，并最終增殖成為

26、無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DN的重排與缺失。 一般而言，形成無質(zhì)粒細(xì)胞的頻率相當(dāng)?shù)?，因此在一般情況下通過隨機(jī)分配質(zhì)粒亦能夠得到穩(wěn)定的遺傳。第六十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 新陳代謝負(fù)荷對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng) 拷貝數(shù)差度對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響 寄主重組體系對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題不同細(xì)胞個體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)的差異程度，簡稱差度低差度-穩(wěn)定 高差度-不穩(wěn)定質(zhì)粒重組的重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它同樣是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的原因之一。重組的質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會以高出質(zhì)粒單體分子兩

27、倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖，第六十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體或病毒DNA噬菌體：細(xì)菌的病毒，常開發(fā)為克隆載體病毒：動、植物的病毒，常開發(fā)為表達(dá)載體共同特點：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第六十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體基本知識一噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型 根據(jù)噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)，可歸納為三種不同的基本類型：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型和線狀體型。大多數(shù)噬菌體，都是屬于第二種結(jié)構(gòu)類型 噬菌體的核酸，最常見的是雙鏈線性DNA。除此之外，還發(fā)現(xiàn)有

28、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線性DNA以及單鏈RNA等多種形式的噬菌體。有些噬菌體的DNA堿基并不是由標(biāo)準(zhǔn)的A、T、G、C四種堿基組成。例如，T4噬菌體DNA中就沒有C堿基。二、噬菌斑：噬菌體細(xì)胞,導(dǎo)致寄主細(xì)胞溶解死亡.因而在瓊脂培養(yǎng)基表面形成的空斑. 第六十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一般溶原性噬菌體的噬菌斑中央殘存著已溶原化的細(xì)胞，故成為混濁噬菌斑。相反，烈性噬菌體則形成透明噬菌斑。第六十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期噬菌體將其感染的寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，能產(chǎn)生出大量

29、的子代噬菌體顆粒。我們將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫做烈性噬菌體。溶源生長周期，是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體 DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個組成部分。具有這種溶源周期的噬菌體，叫做溫和噬菌體。現(xiàn)已知道，只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。噬菌體基本知識第六十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）大腸桿菌的 l 噬菌體DNA1、l 噬菌體的生物學(xué)特性：l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成 l-DNA是線性雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因lDNA兩端各帶有一個12bp

30、的粘性末端，稱為cos位點。 噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過COS位點成環(huán)狀第六十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月l 噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOSCos位點（12bp）頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l - DNA第七十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月l 噬菌體的兩種途徑第七十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月l 噬菌體的裂解途徑生活史E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解lamB受體：麥

31、芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白第七十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月l 噬菌體的裂解途徑l 噬菌體的體內(nèi)包裝 包裝范圍為原DNA的75 - 105%： 36 - 51 kb體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA串連多聚體先行復(fù)制，再經(jīng)環(huán)滾式復(fù)制形成串聯(lián)重復(fù)第七十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月滾環(huán)方式（rolling circle）D.S. DNA Nick leading StrandElongation rolling第七十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6

32、月l 噬菌體的溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶原狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)第七十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、l-DNA載體的構(gòu)建：1）縮短長度：按有效包裝范圍確定 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段

33、不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體第七十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月插入型l-DNA載體：載量為0-14KB體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度 37 kb插入片段大?。? - 14 kb（51 37）改造后的長度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體第七十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月插入型載體： cI基因插入失活：如 gt10、NM11

34、49等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位點，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）。 第七十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月取代型l-DNA載體：載量為10-25kb體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度 10 kb（51 26）載體長度 26 kb插入片段最大裝載長

35、度 25 kb（36 26）長度為40kb，在非必需區(qū)域有酶切位點，距離為14kb第八十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月思考用取代型載體克隆外源DNA可能需要經(jīng)過哪些步驟？第一，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化載體，除去基因組中可取代的 DNA區(qū)段。第二，將上述所得的 DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對重組體的DN A分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的重組 噬菌體。第八十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2）刪除重復(fù)的酶切位點，引入多克隆位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，

36、不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點可以怎么刪除或引入？除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點第八十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3）加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第八十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月加裝選擇標(biāo)記： imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入

37、受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑透明斑渾濁斑第八十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月加裝選擇標(biāo)記：lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑第八十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4）構(gòu)建琥珀密碼子的突變體（環(huán)保的需要） 琥珀型突變（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物

38、校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 第八十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月無義突變使UUG變?yōu)閁AG Leu-tRNA閱讀UAG密碼子AUG UUG UAA AUG UAG UAA AUG UAG UAA AUG UUGUAAAAC AUC AAG 釋放因子 抑制突變 Leu Leu Leu圖1417 帶有

39、突變反密碼子的tRNA可抑制無義突變第八十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、l-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒 密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 第九十張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、l-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。用于

40、體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的第九十一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5、l-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡便 l-DNA

41、載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因第九十二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA1、M13噬菌體的生物學(xué)特性：M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 致使比其他區(qū)域的宿主生長慢,形成混濁噬菌斑M(jìn)13 DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長第九十三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月M13噬菌體載體 M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，這種單鏈片段在

42、遺傳學(xué)研究中主要用來測定序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。 第九十四張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月大小：6.4kb結(jié)構(gòu)：10個區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）含復(fù)制起始位點及可插入外源DNA的位點第九十五張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月M13噬菌體的感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV第九十六張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、M13 DNA載體的構(gòu)建與改造III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VI

43、I IX VIIIM13mp系列載體lacZpolylinkerMCS插入多克隆位點和標(biāo)記基因第九十七張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、M13 DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb第九十八張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）病毒載體 與動植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動植物的病 毒基因組DNA。 動植物病毒種類繁多，每一

44、種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。第九十九張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月動物病毒載體 (1)具有能在動物細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起始位點 (2)具有在動物細(xì)胞中能表達(dá)的選擇標(biāo)記 (3)具有大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制起始位點、選擇標(biāo)記和多克隆 位點 目前常用的基因轉(zhuǎn)移載體有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40簡稱SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳頭狀病毒(Pap

45、illoma virus)；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。第一百張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cos site - carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段裝載范

46、圍為31 - 45 kb三、考斯質(zhì)粒與噬菌粒第一百零一張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月考斯質(zhì)粒載體的特點：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第一百零二張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制起始位點以及質(zhì)粒復(fù)制起始位點、克隆位點、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA第一百零三張，PPT共一百一十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 p