臨床免疫學與檢驗：第八章 熒光免疫技術

1、第八章 熒光免疫技術Immunofluorescence Technique熒光免疫技術是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種免疫分析技術。 Coons等于1941年首次采用異硫氰酸熒光素標記抗體，檢測小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原而獲得成功。1970年后發(fā)展建立起了熒光免疫測定技術(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)。近年來，熒光免疫技術標準化、定量化和自動化階段。熒光免疫技術分為兩大類:熒光抗體染色技術熒光免疫測定 熒光抗體染色技術是用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察結

2、果，稱為熒光免疫顯微技術，或是應用流式細胞儀進行自動分析檢測，稱為流式熒光免疫技術；第一節(jié) 熒光標記物的制備一、熒光和熒光物質二、熒光標記物的制備(一) 熒光1熒光的產生: 一些化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能)而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復至基態(tài)時，過剩的能量以熒光形式釋放出來。光致熒光化學熒光X線熒光或陰極射線熒光。e電子熒光高能級基態(tài)激發(fā)態(tài)2熒光效率 熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率。熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，而是或多或少地以其他形式釋放。3. 熒光壽命 指熒光物質被一瞬時光脈沖激發(fā)后產生的熒光隨時間而衰減到一定程度時所用的時間。4熒光的

3、淬滅 指熒光分子的輻射能力受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱的現(xiàn)象。這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光形式發(fā)射所致。5影響因素 (1)pH (2)溫度(3)熒光素的濃度 (4)雜質對細胞熒光染色的影響 (5)某些細胞固定劑對細胞熒光染色的影響 (6)苯胺、酚、硝基苯及一些鹵化物影響 (二)熒光物質1常見熒光素(1)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) (2)四乙基羅丹明(rhodamine,RB200) (3)四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) (4)

4、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE) 2其他熒光物質(1)鑭系稀土元素 (2)酶作用后產生熒光的物質 二、熒光標記物的制備(一)熒光素標記物的制備1熒光素標記抗體的方法2熒光素標記抗體的純化3熒光素標記抗體的鑒定(二)鑭系稀土元素標記物的制備第二節(jié) 熒光免疫顯微技術Immunofluorescent Microscopy Technique一、基本原理熒光免疫顯微技術是以熒光顯微鏡為檢測工具，用熒光素標記特異性抗體或抗抗體，檢測固定組織細胞上的抗原或血清中的抗體，常用于定性和定位檢查的一門技術。二、技術類型根據(jù)標記物和反應程序的不同，可將熒光免疫顯微技術分為直接法、間接法、補體結合法和

5、雙標記法等四類。1直接法用熒光素標記特異性抗體，將特異性熒光抗體直接滴加于待測標本上，直接與相應抗原反應(圖18-1)。此法常用于細菌和病毒等病原微生物的快速檢測、腎活檢及皮膚活檢的免疫病理檢查。2間接法用熒光素標記抗球蛋白抗體(抗抗體)，待基質標本中的抗原與相應抗體(第一抗體)反應，再用熒光素標記的抗抗體(第二抗體)結合第一抗體，通過熒光現(xiàn)象檢查抗原或抗體(圖18-2)。此法常用于檢測各種自身抗體。3補體結合法用熒光素標記抗補體抗體，待基質標本中的抗原與抗體反應后，加入補體，補體和抗原抗體復合物結合，再加入熒光素標記的抗補體抗體，通過熒光現(xiàn)象檢查抗原或抗體(圖18-3)。4雙標記法用兩種熒光

6、素 (FITC和RB200) 分別標記不同抗體，對同一標本進行熒光染色，若有相應的兩種抗原同時存在，在熒光顯微鏡下用兩種不同的激發(fā)光，同時顯示兩種熒光(黃綠色和橘紅色熒光)，方法與直接法相同。本法主要用于同時觀察細胞表面兩種抗原的分布與消長關系，區(qū)分末梢血或同一切片中T和B細胞等。三、技術要點 熒光免疫顯微技術主要包括標本的制作、熒光抗體染色和熒光顯微鏡檢查等步驟:(一)標本的制作(二)熒光抗體染色(三)熒光顯微鏡檢查 (一) 標本的制作在制備標本過程中，應力求保持抗原的完整性。在染色和洗滌等過程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去。 常見的臨床標本材料主要有組織、細胞和細菌三

7、大類 。涂片、印片或切片 。除活細胞外，其他標本片應在染色前以適當方式固定 (二) 熒光抗體染色在已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體，置帶蓋的濕盒內，在一定溫度下溫育一定時間，一般以2537溫育30min。不耐熱抗原的檢測則以4過夜為宜。溫育后充分洗滌干燥。(三) 熒光顯微鏡檢查 經(jīng)熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結果。熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。 熒光顯微鏡與普通顯微鏡的不同之處在于光源、濾光片、聚光器及鏡頭等。注意事項 1.非特異性熒光染色是直接影響檢測結果的主要問題。 2.對照：陽性對照即為已知的陽性對照。陰性對照包括

8、：用與特異性抗體種屬相同的動物血清或同一動物免疫前的血清標記熒光素代替特異性抗體，結果應為陰性。染色抑制試驗：將未標記熒光素的抗體先與切片的靶抗原反應，然后再加熒光素標記的相同抗體，結果應為弱陽性或陰性。用PBS代替熒光抗體，結果應為陰性。標本自發(fā)熒光對照，即切片標本經(jīng)PBS洗后不加熒光抗體，應為陰性。四、方法評價熒光免疫顯微技術可用于組織學中抗原或抗體的定位、定性檢查，既有抗原抗體反應的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強。其缺點是熒光容易消退，難以制備永久性標本，非特異熒光的干擾常影響結果的判斷。五、臨床應用 熒光免疫顯微技術在臨床檢驗中已用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及

9、自身免疫病的診斷等1血清中自身抗體的檢測 2各種微生物的快速檢查和鑒定 3寄生蟲感染的診斷 4白細胞分化抗原的檢測 5. 人類白細胞抗原(HLA)、腫瘤組織中腫瘤抗原、組織中免疫球蛋白和補體組分、激素和酶的組織定位等的檢測。第三節(jié) 熒光免疫測定技術 fluorescence immunoassay Technique1.非均相熒光免疫測定法：時間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluorescence immunoassay, TR-FIA)熒光酶免疫測定(fluorescence enzyme immunoassay，F(xiàn)EIA)。2.均相熒光免疫測定法：熒光偏振免疫測定(flu

10、orescence polarization immunoassay,FPIA)底物標記熒光免疫測定(substrate-labeled fluorescent immunoassay，SLFIA)一、時間分辨熒光免疫測定 基本原理 技術類型 技術要點 方法評價和臨床應用 (一)、基本原理時間分辨熒光免疫測定是用鑭系稀土元素螯合物(如Eu 3+螯合物)標記抗體或抗原，檢測標本中的相應抗原或抗體。此螯合物具有較長熒光壽命，利用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，可排除標本中非特異性熒光的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。另一個特點是激發(fā)光與熒光的波長差別顯著，其波長轉變達270nm，

11、可有效排除激發(fā)光的干擾，測得的熒光為稀土元素螯合物發(fā)出的特異性熒光信號(圖18-4)。(二)、技術類型1固相雙位點夾心法 2固相抗原競爭法 3固相抗體競爭法 1固相雙位點夾心法使用針對抗原不同決定簇的兩種特異性抗體，一種包被在固相上，另一種用Eu3+標記。標準品或待測抗原先與固相抗體反應，洗滌后再加入Eu3+標記的抗體，再次溫育，形成固相抗體-抗原- Eu3+標記抗體復合物，充分洗滌后加入增強液，測定熒光強度，所測得的熒光強度與待測抗原濃度成正比(圖18-5)。 2固相抗原競爭法將大分子抗原直接（或小分子半抗原通過化學偶聯(lián)法制成半抗原-蛋白質結合物）包被在固相上，成為固相抗原。待測抗原和固相抗

12、原競爭結合定量的Eu3+標記抗體，標本中待測抗原濃度越高，則Eu3+標記抗體結合到固相上的量越少，因此所測得的熒光強度與標本中待測抗原濃度成反比。3固相抗體競爭法待測標本中抗原和Eu3+標記的抗原與固相抗體(特異性抗體包被固相)發(fā)生競爭結合, 溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，所測得的熒光強度與待測抗原含量成反比。目前為了生產試劑盒的方便，常用抗抗體(Ab2)包被固相，這種固相抗抗體實際上是一種通用的分離劑，分離Eu3+標記抗原和Eu3+標記抗原抗體復合物。(三)、技術要點以固相雙位點夾心法檢測(alpha-fetoprotein、AFP)為例。以抗人AFP多克隆抗體包被聚苯乙烯

13、微量滴定條或珠，加入不同濃度的AFP標準品和待測血清，加入緩沖液反應46h。洗滌后，加入生物素化抗人AFP單克隆抗體，振蕩溫育反應46h。洗滌后，加入Eu3+標記的鏈霉親和素，振蕩反應1h。洗滌后，加入增強液，快速振蕩15min，放置15min后在時間分辨熒光分析儀上測量，根據(jù)標準曲線計算得出待測血清中AFP濃度。(四)、方法評價和臨床應用TR-FIA方法特異性強，靈敏度高(可達0.21ng/ml)。標準曲線范圍寬 (跨越45個數(shù)量級)。分析速度快。標記物制備較簡便、有效使用期長，無放射性污染。檢測項目多：各種激素(肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等)、蛋白質、酶、藥物、腫瘤標記物和病毒抗原等

14、。二、熒光偏振免疫測定基本原理技術要點方法評價和臨床應用(一)、基本原理熒光偏振免疫測定是利用熒光素經(jīng)偏振光照射而躍入激發(fā)態(tài)，在回復至基態(tài)后可釋出光子，經(jīng)偏振儀形成偏振熒光，熒光偏振強度與熒光分子的大小成正比的關系而建立的免疫分析技術。 FPIA是一種均相競爭熒光免疫分析法。其原理：待測的小分子抗原和熒光素標記的小分子抗原(恒定量)與相應抗體(恒定量)競爭結合。當待測的小分子抗原濃度高時，經(jīng)過競爭反應，大部分抗體被其結合。而熒光素標記的小分子抗原多呈游離狀態(tài)，因其分子小，在液相中轉動速度較快，測量到的熒光偏振強度也較低。反之，如待測的小分子抗原濃度低時，大部分熒光素標記的小分子抗原與抗體結合，

15、形成大分子的標記抗原抗體復合物，此時檢測到的熒光偏振強度也較高，即熒光偏振強度與待測小分子抗原濃度呈反比(圖18-6)。通過小分子抗原標準品與熒光偏振強度關系建立標準曲線，可檢測小分子抗原的濃度。(二)、技術要點 以環(huán)孢素測定為例。1標本的預處理 取待檢全血，加入溶解劑和蛋白沉淀劑，混勻后離心，上清待用。2抗原抗體反應 在反應管中分別加入一定量的預處理標本上清、熒光素標記的環(huán)孢素、抗環(huán)孢素單克隆抗體及反應緩沖液進行抗原抗體反應。3偏振熒光強度測定 抗原抗體反應開始時，立即用熒光偏振免疫分析儀測定其空白偏振熒光強度(P1)，反應結束時再測定其偏振熒光強度(P2)，根據(jù)待測標本的偏振熒光強度P(P2-P1)，從標準曲線上直接計算出所測物質的含量。(三)、方法評價和臨床應用FPIA方法具有下述優(yōu)點：均相測定方法簡便，易于快速、自動化進行。熒光標記試劑穩(wěn)定、有效期長，并使測定的標準化結果可靠?？捎每瞻仔Ｕ?/p>