細(xì)胞免疫熒光詳細(xì)步驟

1、細(xì)胞免疫熒光步驟【原理】用特異性抗體（第一抗體）與細(xì)胞中的相應(yīng)抗原反應(yīng)，洗去未與 抗原結(jié)合的抗體再用熒光標(biāo)記的第二抗體與結(jié)合在抗原上第一 抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體復(fù)合物由于熒光素在熒光顯 微鏡下經(jīng)過特定波長(zhǎng)的光照攝激發(fā)后能發(fā)射出熒光，借此可對(duì)抗 原定位和定量。【材料】培養(yǎng)細(xì)胞【試劑】4%的多聚甲醛。PBS （0.18M PHM7.2）: NaCl 18 克，Na2HPO 4. 12H2O 12 克，NaH2PO4,2H20 0.8 克溶于 2000m 蒸餾水。封閉血清：與二抗同種來源屬性的非免疫血清。第一抗體：XXX。第二抗體：與一抗種屬性匹配TRITC標(biāo)記的，（中杉金橋公司，ZF-

2、0313Goat Anti-Mouse IgG （H+L）,）。DAPI ：（碧云天 公司，Cat. C1006）染核?？篃晒獯銣绶馄瑒?碧云天公司 Cat .PO126【器材】 冰箱，載玻片，蓋玻片（做正面標(biāo)記），微量移液槍，移液槍槍頭，吸管，濕盒，指甲油，DOCK筆，EP管， 吸水紙，六孔板，搖床，振蕩器?！九渲埔后w等】 0.5%-Triton : （ PBS 99.5ml +0.5mlTriton 由于 Triton 比較粘，配前先在室溫放會(huì)兒,磁力攪拌器攪勻可分裝儲(chǔ)存）10%正常封閉血清 ：（用PBS-Triton稀釋，振 蕩器上振蕩充分混勻，臨用前配制）。0.3%-Tween；用

3、PBS 稀釋Tween?！静襟E】1取出生長(zhǎng)48小時(shí)的細(xì)胞爬片，移入一個(gè)干凈的六孔板冷PBS浸泡不超 過3分鐘（事先在六孔板的第一排三個(gè)孔分別標(biāo)記）。2每個(gè)玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分鐘。注意，要水平，覆蓋 均勻。（準(zhǔn)備封閉血清用 PBS-Triton 稀釋 1:10振蕩器上振蕩混 勻）。冷PBS,5分鐘X2次 搖床150rpm緩慢洗凈，PBS-Triton透膜5min。 （如果是胞漿，核或膜內(nèi)表面表達(dá)需要這一步，如果是膜外表面表達(dá)的則不需要透膜）擦干爬片邊緣，用DOCK筆在爬片四周邊沿畫圈（以防止爬片上所 加試劑因失去張力流失，導(dǎo)致干片）。將爬片分別放入六孔板下排與上排標(biāo) 記相對(duì)應(yīng)的孔

4、內(nèi)（該加封閉血清了，此時(shí)要求板是干燥的，下一排板沒用 過是干燥的）。用微量移液槍，在每張爬片上加10%正常封閉血清，室溫濕盒中 阻斷30 min（準(zhǔn)備一抗，用 PBS-Triton 稀釋 抗體1:100振蕩 器上振蕩混勻）。一抗孵育：加巳經(jīng)稀釋好的一抗， 用微量移液槍小心加一抗，（逐 個(gè)片去封閉液，擦干圈外水，加一抗注意：不要碰細(xì)胞）置濕盒中，4冰 箱過夜，剩余的一抗保留。.次日，輕輕去蓋，查看張力還在。輕輕移至室溫，濕盒內(nèi)再孵育1小時(shí)。 注意不干片。PBS-Tween洗，3次x5min （據(jù)情況適當(dāng)變化），。9將爬片四周擦干，再將其分別放回六孔板上一排原先的孔內(nèi)。（加二 抗，上一排板巳干，所以再移回上一排板中）。10.避光處，加二抗覆蓋均勻 平放室溫孵育一小時(shí)（由于試劑會(huì)揮發(fā)，此間要查看，適當(dāng)補(bǔ)加二抗避免干片）。11避光處,，PBS-Tween洗3次X5min （據(jù)情況適當(dāng)變化），輕輕的。12避光處，待爬片晾干，加DAPI （一小滴），室溫孵育4min，PBS-Tween 洗3次，用手晃動(dòng)洗滌。13避光處，待爬片晾干，往載玻片上滴加封片劑，爬片倒扣于封片劑上， 用指甲油封爬片四周（