LncRNA研究之lncRNA芯片分析

1、LncRN頌究之IncRNA芯片分析LTLncRNA研究之IncRNA芯片分析IncRNA芯片分析L歸一化IncRNA芯片采用的歸一化的方法為 quantile normalization。2.差異 LncRNA 的篩選 IncRNA芯片中既有IncRNA的探針又有mRNA的探針，分 別做差異基因的篩選，篩選方法同表達(dá)譜的篩選方法是一致 的，參見(jiàn)表達(dá)譜的差異基因篩選。3.差異IncRNA的重注 釋IncRNA芯片注釋不完善，因此需要將篩選出來(lái)的IncRNA 進(jìn)行重注釋。將差異IncRNA在基因組上位置上下游延伸， 以尋找IncRNA附近的有功能的基因。4.差異IncRNA靶基因的預(yù)測(cè)IncRN

2、A可能通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的 mRNA發(fā)揮功能，因此有必要預(yù)測(cè)IncRNA的靶基因。我們 提取差異IncRNA和mRNA的序列，首先用blast進(jìn)行初篩, 之后用RNAplex進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以預(yù)測(cè)IncRNA可能調(diào)控 的 mRNAo.差異IncRNA與靶基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)出IncRNA的靶基因后，并可進(jìn)一步在mRNA的數(shù)據(jù)中探尋該mRNA是否發(fā) 生表達(dá)量的變化。由此構(gòu)建差異IncRNA與靶基因相互作用 網(wǎng)絡(luò)圖。.差異IncRNA與差異mRNA的共表達(dá)分析SBC Human IncRNA芯片能同時(shí)檢測(cè)出差異表達(dá)的IncRNA和mRNA。我們將差異IncRNA和差異mRNA在一組樣品中進(jìn)行共表達(dá) 分析，

3、可以發(fā)現(xiàn)與某個(gè)IncRNA具有相同表達(dá)模式的mRNAo 要求：每組數(shù)據(jù)3個(gè)或3個(gè)以上生物學(xué)重復(fù) 實(shí)驗(yàn)組： 對(duì)照組：7.差異IncRNA靶基因的GO analysis對(duì)IncRNA 的靶基因進(jìn)行GO Ontology的生物學(xué)的分類，根據(jù)Fishers Exact Test彳導(dǎo)到p-value,得到IncRNA靶基因?qū)?yīng)的顯著性 功能，從而了解IncRNA的功能0 8.差異IncRNA靶基因 的pathway analysis對(duì)IncRNA靶基因按照Pathway的主要 公共數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG和Biocarta來(lái)進(jìn)行分類，對(duì)Pathway中 的基因進(jìn)行基于離散分布的顯著性分析，得到與實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠?顯著聯(lián)

4、系的Pathway分類,由這些pathway對(duì)應(yīng)相應(yīng)的靶基 因，從而獲得該分類即導(dǎo)致IncRNA差異的最重要Pathwayo 9.差異IncRNA的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)提取IncRNA TSS的上游 2000bp,下游500bp，利用HMM的算法根據(jù)TRANSFAC8.1 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子。10.IncRNA cis作用機(jī)制研究：對(duì) 于感興趣的差異表達(dá)IncRNAs,搜索其上下游100K范圍內(nèi) 的所有編碼基因，并與該IncRNAs有顯著共表達(dá)的基因取 交集。這些在基因組上臨近、且表達(dá)模式上共表達(dá)的基因很 可能被該IncRNAs所調(diào)控。11. IncRNA trans作用機(jī)制研究：計(jì)算LncRNA

5、s共表達(dá)的 編碼基因，集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物的靶基因集合 的交集，利用超幾何分布計(jì)算該交集的富集程度，得到與 IncRNAs顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而識(shí)別可能與IncRNAs聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子 /染色質(zhì)調(diào)控因子。綜述長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (IncRNA) IncRNA長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long noncoding RNA , IncRNA )是一類不編碼蛋白的 RNA 分子， 長(zhǎng)度在200bp以上，起初被認(rèn)為是 RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的 副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能；近期的研究表明IncRNA具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，尤其在腫

6、瘤當(dāng)中發(fā)揮了重要的 調(diào)控角色，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)解以 及作為miRNA的誘導(dǎo)分子干擾基因的表達(dá)等。隨著高通量 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的IncRNA被注釋，但是絕大多數(shù)的IncRNA的功能仍然不清楚，因此IncRNA 的研究是一 片非常廣闊的未知領(lǐng)域，具有極大的研究?jī)r(jià)值和意義。IncRNA 介紹長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA , IncRNA )是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò) 200nt、不編碼蛋白的 RNA。 lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué) 功能。然而，近年來(lái)的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)

7、，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸 等多種重要的調(diào)控過(guò)程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都 有著密切聯(lián)系。為何細(xì)胞不惜耗費(fèi)能量對(duì)這些非編碼RNA的表達(dá)和定位進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控呢？這些RNA分析究竟有何功能？ RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使人們得以初窺這一神秘分子，現(xiàn)在IncRNA的許多相關(guān)信息都可以再新數(shù)據(jù)庫(kù)中查到，例如Broad研究所、哈佛大學(xué)和麻省理工共同開(kāi)發(fā)的HumanBody Map lincRNAs catalog 。雖然近年來(lái)關(guān)于 IncRNA 的 研究進(jìn)展迅猛，但是現(xiàn)在人們了解到的lncRNA只是冰山一角，絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。隨著

8、研究 的推進(jìn)，各類lncRNA的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究作為RNA 研究的新領(lǐng)域，已經(jīng)成為一個(gè)非常吸引人的方向，有待廣大 科學(xué)家去探尋。lncRNA研究當(dāng)前面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是， 研究工具還在不斷開(kāi)發(fā)和改進(jìn)中，而lncRNA研究中非常關(guān)鍵的一步就是發(fā)現(xiàn)與特定疾病相關(guān)的lncRNA o現(xiàn)階段，基因芯片技術(shù)發(fā)展趨于成熟穩(wěn)定，在此平臺(tái)上，通過(guò)設(shè)計(jì)不同 檢測(cè)lncRNA探針篩選lncRNA是一種準(zhǔn)確快捷的方法。lncRNA 特征lncRNA 通常較長(zhǎng)，具有 mRNA 樣結(jié)構(gòu)，有些 具有poly(A)尾巴，有些沒(méi)有poly(A)尾巴，分化過(guò)程中有動(dòng) 態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方式，與編碼基因相比，lncR

9、NA表達(dá)量更低。冰 組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達(dá)量不同。X時(shí)空特異性：同一組織或器官的不同生長(zhǎng)階段，其 中的lncRNA表達(dá)量也會(huì)變化。X lncRNA啟動(dòng)子同樣可以 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如 Oct3/4 , Nanog , CREB, Sp1 , c-myc , Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式 與結(jié)構(gòu)特征。派大多數(shù)的lncRNA在組織分化發(fā)育過(guò)程中， 都具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性，如有人針對(duì)小鼠的1300個(gè)IncRNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，IncRNA具有不同的表達(dá)模式。派在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達(dá) 方式。IncRNA的亞細(xì)胞位置上也呈多

10、樣化，在細(xì)胞核、 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有獨(dú)特的亞細(xì)胞位置，有可能是全新的亞細(xì)胞構(gòu)成。IncRNA功能IncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后 加工等多種層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控：a） IncRNA通過(guò)招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物至特定的基因組位點(diǎn)使其發(fā)生催化活 性。如 HOTAIR21 , Xist、RepA 和 Kcnqotl 招募 Polycomb complex 至HoxD 位點(diǎn)，使得 X染色體或 Kcnq1功能域的 組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生3甲基化（me3K27 ）,誘導(dǎo) 異染色質(zhì)形成，從而抑制該區(qū)域基因表達(dá)。b） lncRNA通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。l

11、ncRNA結(jié)合到基因cyclin D1上，招募RNA結(jié)合蛋白TLS來(lái)調(diào)控蛋白CBP和p300的組 蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄。c）超保守增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄由lncRNA-Evf2 ,該lncRNA能激活轉(zhuǎn)錄因子 DLX2 ,進(jìn)而調(diào)控基因 Dlx6轉(zhuǎn)錄。d） DHFR次要啟動(dòng)子區(qū)域 轉(zhuǎn)錄由的lncRNA與該基因主要啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成三聚 體，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合，從而使基因DHFR發(fā)生沉默。 e）反義lncRNA能夠與剪接體（splicesome ）中鋅指同源 mRNA Zeb2的5剪切位點(diǎn)結(jié)合，使內(nèi)含子未被剪切掉，而 該內(nèi)含子序列中保留有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRE位點(diǎn)），

12、翻 譯過(guò)程中識(shí)別并結(jié)合該位點(diǎn)，導(dǎo)致 Zeb2基因表達(dá)和翻譯, IncRNA分子機(jī)制隨著IncRNA功能逐步顯現(xiàn)，具與靶點(diǎn)的作用機(jī)制成為進(jìn)一步的熱點(diǎn)。早期認(rèn)為原位調(diào)控是LncRNA作用的唯一機(jī)制，它通過(guò)招募形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物而沉默 鄰近基因轉(zhuǎn)錄，例如 IGF2R反義RNA（antisense of IGF2RRNA ,AIR）、XIST 等。而 Hox 基因反義基因間 RNA（Hox antisense intergenic RNA , HOTAIR）的發(fā)現(xiàn)提示 LncRNA 可能存在遠(yuǎn)程調(diào)控。同源異型基因（homeotic genes , HOX）在細(xì)胞增殖與定向分化中起關(guān)鍵作用，人類Hox

13、基因簇約含100個(gè)ncRNA 基因，其中 HOTAIR定位于HOXC基因座 12q13.13 o HOTAIR的5端可招募結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合物 2（polycomb repressive complex2 , PRC2）,借助 PRC2 上 三個(gè)H3K27甲基化酶 EZH2、SUZ12和EED,使另一基因座 HOXD上長(zhǎng)約40kb的序列轉(zhuǎn)錄沉默，從而在乳腺上皮細(xì)胞 內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄傾向于胚胎成纖維細(xì)胞樣表型。超過(guò)20%的LncRNA能夠通過(guò)結(jié)合PRC2或其他類似復(fù)合物發(fā)揮作用， 提示LncRNA的遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制在生物體內(nèi)廣泛存在。其作用機(jī)制如下圖所示，主要包括以下幾種情況：1）在編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)（橘色）轉(zhuǎn)錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因（藍(lán)色）的表達(dá)（如醉母SER3基因）；2）抑制RNA聚合酶n,或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而 影響基因（藍(lán)色）表達(dá)；3） lncRNA （紫色）與編碼蛋白基因的