測定葉綠素a和b的方法及其計算

1、實驗二十五 測定葉綠素a和b的方法及其計算時間：2021.01.01創(chuàng)作歐陽美一目的要求：熟悉在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測定葉綠素a和 b的方法及其計算。二實驗原理：如果混合液中的兩個組分，它們的光譜吸收峰雖然有 明顯的差異，但吸收曲線彼此有些重疊，在這種情況下要分 別測定兩個組分，可根據(jù)Lambert-Beer定律，通過代數(shù)方 法，計算一種組分由于另一種組分存在時對光密度的影響， 最后分別得到兩種組分的含量。如圖z-4葉綠素a和b的吸收光譜曲線，葉綠素a的最 大吸收峰在663nm,葉綠素b在645nm,吸收曲線彼此又有 重疊。圖z-4葉綠素a和b的吸收光譜曲線橫坐標為波長（mn）,縱坐標為

2、比吸收系數(shù)根據(jù)Lambert-Beer定律，最大吸收光譜峰不同的兩個組 分的混合液，它們的濃度C與光密度0D之間有如下的關(guān) 系：0Dl=Ca kal+Cb kbl（1）0D2=Ca ka2+Cb kb2（2）式中：Ca為組分a的濃度，g/LoCb為組分b的濃度，g/Lo0D1為在波長入1 （即組分a的最大吸收峰波長）時，混 合液的光密度0D值。0D2為在波長入2 （即組分b的最大吸收峰波長）時，混 合液的光密度0D值。koi為組分a的比吸收系數(shù)，即組分Q當濃度為lg/L 時，于波長X 1時的光密度0D值。kb2為組分b的比吸收系數(shù)，即組分b當濃度為lg/L 時，于波長入2時的光密度0D值。ka

3、2為組分a （濃度為lg/L）,于波長入2時的光密度 0D值。kbl為組分b （濃度為lg/L）,于波長入1時的光密度0D值。從文獻中可以查到葉綠素a和b的80%丙酮溶液，當濃度為lg/L時，比吸收系數(shù)k值如下:波長（nm）葉綠素a葉綠素b66382.049.2764516.7545.60將表中數(shù)值代入上式（1）、（2）,則得:0D663二82. 04X5+9. 27XCb 0D645二 16. 75X5+45. 60XCb經(jīng)過整理之后，即得到下式:5二0.0127 OD663-0.00269 0D645Cb=0.0229 0D645-0.00468 0D663如果把Ca, Cb的濃度單位從原

4、來的g/L改為mg/L,則上式可改寫為下列形式：Ca=12.70D663-2.690D645Cb二22. 90D645-4.680D663CT二 Ca+Cb=8.02 0D663+20. 210D645（5）（5）式中CT為總?cè)~綠素濃度，單位為mg/Lo利用上面（3）、（4）、（5）式，即可計算出葉綠素a和b及總?cè)~綠素的濃度（mg/L）。附注一般大學(xué)教學(xué)實驗室所用的分光度計多為721型，屬 低級類型，其單色光的半波寬要比中級類型的751型寬得多，而葉綠素3和b吸收峰的波長相差僅18nm （663-645nm）,難以達到精確測定。此外有時還由于儀器本身的 標稱波長與實際波長不符，測定的正確性就更

5、差，不適用于 測定。751型有時也由于波長不夠準確，會帶來一定誤差。可用葉綠素對波長進行校正。為校正儀器波長所需的葉綠素a和b的需要量很少，用 紙層析法很快就能分離制得。取植物葉子約lg,用乙瞇提取 葉綠體色素，再用毛細管將色素溶液畫在3mm厚濾紙上使成 一宜線，為使分離效果好，一般重復(fù)點樣一次即可。然后于 密閉容器中進行上行層析，溶劑為含有0.5%丙酮的石油瞇。 層析結(jié)束，用剪刀小心地剪下藍綠色的葉綠素a和黃綠色的 葉綠素b,注意剪時盡量避開分層不清晰的色區(qū)。最后分別 浸于80%丙酮中，洗下葉綠素a和b。三 實驗器材與試劑：1.實驗儀器 高級型分光光度計、 離心機、臺天平、剪刀、研缽、漏斗、

6、移液管。2實驗試 劑 丙酮、碳酸鈣。3.實驗材料 植物葉片。四 操作步驟： 1、色素的提?。喝⌒迈r葉片，剪去粗大的葉脈并剪成碎 塊，稱取0. 5g放入研缽中加純丙酮5ml,少許碳酸鈣和石 英砂，研磨成勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入量筒中，并用適量80%丙酮 洗滌研缽，用80%丙酮定容至10ml,吸取2. 5ml加入有 10ml80%丙酮的量筒中，過濾，濾液備用。2、測定光密度： 取上述色素提取液4ml,轉(zhuǎn)入比色杯中，以80%丙酮為對 照，分別測定663nm. 645nm處的光密度值。3、按公式(3)、(4)、(5)分別計算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b、及葉綠素a+b的濃度。再根據(jù)稀釋倍數(shù)分別計算每g 鮮重葉片中色素的含量?！咀⒁馐马棥?由于植物葉子中含 有水分，故先用純丙酮進行提取，以使色素提取液中丙酮的 最終濃度近似80%。2.由于葉綠素a. b的吸收峰很陡，儀 器波長稍有偏差，就會使結(jié)果產(chǎn)生很大的誤差，因此最好能 用波長較正確的高級型分光光度計。五作業(yè)：1、試比較陰 生植物和陽生植物的葉綠素a