堿基平衡性與barcode選擇

1、二代測(cè)序：堿基平衡性與barcode選擇2015-02-01 / YellowTree / #NGS #測(cè)序技術(shù) #堿基平衡性 #barcode堿基平衡性堿基復(fù)雜度與堿基多樣性是一個(gè)意思；復(fù)雜度高，堿基即平衡。低多樣性(low diversity)即堿 基不平衡，指堿基的組成太單純了，種類少。堿基復(fù)雜度本來無關(guān)緊要，從前除了設(shè)計(jì)PCR 的時(shí)候考慮高GC(GC-rich)以外，基本沒人思考這個(gè)問題，沒人覺得這是一個(gè)問題。隨著 Illumina的二代測(cè)序技術(shù)風(fēng)靡全球，獨(dú)占鰲頭，這個(gè)不起眼的概念意外地變得重要起來。一、概念對(duì)于一個(gè)基因來說，它所包含的堿基種類越多，則堿基復(fù)雜度越高；如果各種堿基的百分

2、含 量越接近一致，則堿基組成越平衡。假設(shè)一個(gè)DNA片段，它的全部堿基都是A，AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA顯然其堿基組 成是極度不平衡的。DNA堿基有4種：AGCT。所以堿基最平衡的情況就是：A=%G=%C=%T=25%，比如這樣的DNA 片段：AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCT以上是從縱的方面講的。對(duì)于二代測(cè)序，更重要的是橫的方面。假設(shè)12個(gè)基因整整齊齊站 成一排，第一個(gè)位置的12個(gè)堿基如果都是A，復(fù)雜度太低，嚴(yán)重不平衡；如果A和G各有 6個(gè)，雖然平衡了，但是復(fù)雜度還是不夠；如果AGCT各有3個(gè)，最復(fù)雜，也最平衡；如果 A3個(gè)G4個(gè)C4個(gè)，T1

3、個(gè)，雖然復(fù)雜，但是嚴(yán)重不平衡。二、影響4張濾色片，在4個(gè)波長(zhǎng)處收集信號(hào)，然后合成，進(jìn)行cluster定位及其他運(yùn)算。如果缺少一 種堿基，該波長(zhǎng)的照片就是全黑的，沒有信號(hào)，無法完成圖片合并以及cluster定位，導(dǎo)致 數(shù)據(jù)浪費(fèi)。需要特別注意堿基復(fù)雜度的二代測(cè)序應(yīng)用:PCR產(chǎn)物測(cè)序，特別是用于鑒定細(xì)菌、真菌以及 其他物種的16S rRNAPCR產(chǎn)物測(cè)序；小RNA測(cè)序；甲基化測(cè)序。三、增加堿基復(fù)雜度的方法文庫：把不同的文庫混合在一起。如果沒有其他文庫，那么摻入人基因組DNA文庫、人外顯子組文庫或者PhiX標(biāo)準(zhǔn)品。這些 都是已知堿基平衡的。引物：對(duì)于PCR產(chǎn)物來說，只要引物長(zhǎng)度不同，就能自然錯(cuò)開，增加

4、堿基復(fù)雜度。采用多對(duì)序列不同的引物來完成擴(kuò)增，然后將產(chǎn)物混合在一起。Barcodes：仔細(xì)挑選barcode組合，確保每個(gè)位置都有3-4種堿基且堿基分布均勻。barcode 選擇很多情況下，我們需要把多個(gè)樣本混合在一起，在同一個(gè)通道(lane)里完成測(cè)序。像轉(zhuǎn)錄組 測(cè)序、miRNA測(cè)序、IncRNA測(cè)序、ChIP測(cè)序等等，通常每個(gè)樣本所需要的數(shù)據(jù)量都比較少， 遠(yuǎn)少于HiSeq 一個(gè)通道的產(chǎn)出能力，混合樣本是非常常見。以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槔?，一個(gè)樣本測(cè) 序60 M reads (8G PF data)，就能夠滿足絕大部分研究所需。而HiSeq2500-PE125的一條通 道，使用V4試劑，數(shù)據(jù)產(chǎn)出48

5、0 M reads。為了充分利用測(cè)序儀產(chǎn)能，節(jié)約成本，需要把 78個(gè)RNA樣本混合起來。為了能夠把測(cè)序數(shù)據(jù)按樣本分離(de-multiplexing)，在構(gòu)建文庫(library)的時(shí)候，需要用不 同的標(biāo)簽序列(index,也叫barcode)對(duì)文庫進(jìn)行標(biāo)記。只有文庫作了記號(hào)，數(shù)據(jù)才能區(qū)分。 Barcode的選擇是一門技術(shù)活。如果barcode組合不佳，標(biāo)簽序列測(cè)序質(zhì)量下降，部分或者 全部標(biāo)簽堿基識(shí)別不正確，將導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)無法歸屬到任何一個(gè)樣本，成為undetermined 數(shù)據(jù)，造成浪費(fèi)。一、如何判斷barcode組合好壞堿基平衡。好的barcode組合必須是“4種堿基達(dá)到平衡”的，或者說堿

6、基復(fù)雜度高。具體 就是：在一組barcode的每一個(gè)位置，同時(shí)存在A、G、C、T四種堿基，不缺少任何一種堿基；這4種堿基的比例接近，最好各14,分別為25%左右，沒有任何一種堿基特別多或者特 別少。激光平衡。受客觀條件限制試劑盒提供的barcode種類有限有些barcode已經(jīng)被其他樣本占用，導(dǎo)致可選的余地受限制，這就導(dǎo)致barcode組合經(jīng)常 無法達(dá)到理想的堿基平衡要求。退而求其次，要力?！凹t綠激光達(dá)到平衡”。在所有型號(hào)的Illumina測(cè)序儀中，A和C兩種堿基共用一種激光，由波長(zhǎng)660 nm的紅激光 激發(fā)；G和T共用一種激光，由波長(zhǎng)532 nm的綠激光激發(fā)。對(duì)于一組barcode的每一個(gè)位

7、 置，如果A+C的總數(shù)與G+T的總數(shù)相接近，可以在一定程度上彌補(bǔ)堿基不平衡的負(fù)面作 用。3、激光平衡是次優(yōu)選擇，不得已而為之。它雖然可以在一定程度上提高barcode測(cè)序質(zhì)量， 減少de-multiplexing出問題的可能性，但是并不是說，只要激光平衡了，測(cè)序數(shù)據(jù)的分離就 一定不受影響。4、如果barcode組合堿基也不平衡，激光也不平衡，則de-multiplexing風(fēng)險(xiǎn)非常高。二、Barcode組合舉例好的組合。Illumina推薦的12個(gè)樣本barcode組合如下。編號(hào) 序列01 ATC ACG02 CGA TGT03 TTA GGC04 TGA CCA05 ACA GTG06 GC

8、C AAT07 CAG ATC08 ACTTGA09 GATCAGTAG CTTGGCTACCTT GTA為例，A:G:C:T=3:3:3:3=1:1:1:1。實(shí)際上，該barcode組合每個(gè)位置的堿基比例都接近1:1,堿 基平衡度近乎完美。不好的組合下面的組合有缺陷。比如說，第1個(gè)位置只有A和C兩種堿基，A、C都屬于紅激光，導(dǎo)致 綠激光沒有信號(hào)，堿基和激光都不平衡。AGT TCCACT GATACG AGCACT CCTCAA AAGCAA CCACAC CAG三、Barcode堿基不平衡的后果如果barcode組合的堿基組成不平衡，會(huì)導(dǎo)致測(cè)序進(jìn)行到這些堿基時(shí)，軟件對(duì)測(cè)序信號(hào)的處 理出現(xiàn)障礙

9、，不能準(zhǔn)確地識(shí)別這些堿基(base-calling)，表現(xiàn)為QV值降低，Q30曲線波動(dòng)。 在這種情況下，運(yùn)用生物信息軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分離(de-multiplexing)出現(xiàn)困難， 部分?jǐn)?shù)據(jù)不能準(zhǔn)確分離，成為undetermined數(shù)據(jù)的一部分，造成undetermined數(shù)據(jù)增多， 可分離的數(shù)據(jù)減少。如果測(cè)序數(shù)據(jù)的總量很多，遠(yuǎn)大于全部樣本數(shù)據(jù)量期望值的總和，則問題有可能不那么嚴(yán)重， 全部或者大部分樣本仍然可能分離到足夠的數(shù)據(jù)量。萬一樣本性質(zhì)特殊，反應(yīng)效率低；或者混合樣本之間競(jìng)爭(zhēng)和抑制嚴(yán)重，導(dǎo)致測(cè)序數(shù)據(jù)總量在 期望值附近，余量很少；或者其中個(gè)別樣本數(shù)據(jù)量特別少，這時(shí)如果undetermi

10、ned數(shù)據(jù)比 例過高，就會(huì)導(dǎo)致部分或者全部樣本的數(shù)據(jù)量不夠用?；旌蠘颖狙a(bǔ)數(shù)據(jù)是一個(gè)非常麻煩的問題，成本極高。如果一組樣本中只有個(gè)別樣本需要補(bǔ)數(shù) 據(jù)，由于文庫是混合在一起的，其他樣本也不得不跟著重測(cè)一次。這是困難之一。困難之二， 如果數(shù)據(jù)缺口比較小，本來可以與其他樣本混合，搭個(gè)便車，可是，進(jìn)行第二次混合的時(shí)候， 經(jīng)常會(huì)遇到barcode沖突或者堿基不平衡，拼lane非常困難，往往要等很長(zhǎng)時(shí)間，才有合適 的機(jī)會(huì)。四、實(shí)驗(yàn)證明de-multiplexing成功，該barcode組合今后是否一定好用如果barcode組合堿基平衡，則無論樣本怎么變，該組合一定好用。如果barcode組合的堿基組成不理想

11、，即使以前的實(shí)驗(yàn)證明好用，不等于今后一定好用。下 一次測(cè)序效果可能好，也可能不好。這是由于不同的項(xiàng)目樣本不同，有可能導(dǎo)致兩種后果：數(shù)據(jù)總量在期望值附近，余地不夠多，de-multiplexing后部分樣本數(shù)據(jù)量不夠；如果新的樣本本身也堿基不平衡，read 1測(cè)序質(zhì)量很差，會(huì)影響到barcode和read2的測(cè) 序質(zhì)量。當(dāng)然，情況b責(zé)任不在barcode，即使barcode很好，數(shù)據(jù)還是不夠。五、補(bǔ)救措施如果滿足以下兩個(gè)條件：混合樣本的數(shù)據(jù)總量足夠，只是由于barcode質(zhì)量不好，導(dǎo)致de-multiplexing后部分或全 部樣本數(shù)據(jù)量不夠；排除QV值低的barcode堿基后，其余質(zhì)量好的ba

12、rcode堿基仍然足夠用來區(qū)分全部樣本; 那么，可以通過改變de-multiplexing算法來為每個(gè)樣本獲得盡量多的數(shù)據(jù)。比如去掉信號(hào)識(shí) 別模糊的堿基，或者增加mismatch堿基的數(shù)目，重新運(yùn)行de-multiplexing程序。六、樣本少于4種，不可能堿基平衡，怎么辦如果樣本數(shù)少于4種，每一個(gè)位置的堿基最多只有3種，不可能堿基平衡，怎么辦呢？這時(shí)一定要保證激光平衡。Illumina推薦了 3種low-level pooling的barcode組合：2個(gè)樣本：#6 GCC AAT#12 CTT GTA3個(gè)樣本：#4 TGACCA#6 GCCAAT#12 CTTGTA6個(gè)樣本：#2 CGATGT#4 TGA