熒光分光光度法

1、熒光分光光度法測定維生素B的含量6熒光分光光度法測定維生素B的含量6熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種 儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光 壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情 況。通過對這些參數(shù)的測定，不但可以做一般的定量分析，而且還可以推 斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化，從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。 熒光分光光度計的激發(fā)波長掃描范圍一般是190-650nm，發(fā)射波長掃描范圍是200-800nm。可用于液體、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。熒光分光光度計的工作原理：物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于 基態(tài)

2、的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn) 定的，在返回基態(tài)的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒 光.不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同，其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的 特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射 光譜；，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來定性地進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時，其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常 有良好的正比關(guān)系，即IF=KC,利用這種關(guān)系可以進(jìn)行熒光物質(zhì)的定量分析， 與紫外-可見分光光度法類似，熒光分析通常也采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行。哉發(fā)單也番摯一光譜熒光分光光度計基本結(jié)構(gòu)：光源：為高壓汞蒸氣燈或氙孤燈，

3、后者能發(fā)射 出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特 定的激發(fā)光譜。發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第 二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。樣品室：通常由石 英池（液體樣品用）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）組成。測量液體時，光源與檢 測器成直角安排；測量固體時，光源與檢測器成銳角安排。檢測器：一般用光 電管或光電倍增管作檢測器?？蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D(zhuǎn)為電信號。熒光分光光度計是用于電子掃描液相熒光標(biāo)志物所拍發(fā)的熒光光譜的一種 攝譜儀。應(yīng)用于科學(xué)研究、化工、醫(yī)療藥品

4、、生化、環(huán)保和臨床檢驗、食物檢驗、 講授實驗等領(lǐng)域。本次實驗所用樣品維生素B6（vitamin B6），又稱毗哆素。是一種水溶性維 生素，遇光或堿易破壞，不耐高溫。一種含毗哆醇或毗哆醛或毗哆胺的B族維生 素。1936年定名為維生素鳥。維生素B6無色晶體，易溶于水及乙醇，在酸液 中穩(wěn)定，在堿液中易破壞，毗哆醇耐熱，毗哆醛和毗哆胺不耐高溫。維生素B6 在酵母菌、肝臟、谷粒、肉、魚、蛋、豆類及花生中含量較多。維生素B6人 體內(nèi)某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應(yīng)，尤其是和氨基酸代謝有密切關(guān)系。 臨床上應(yīng)用維生素B6制劑防治妊娠嘔吐和放射病嘔吐。維生素B6及其輔酶的結(jié)構(gòu)式1實驗儀器與試劑1.1儀器熒光

5、分光光度計（RF-5301PC,日本島津）、電子天平（AL204，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司METTLER TOLEDO）、微孔濾膜（尺寸25mm，孔徑0.8u,上海半島實業(yè)有限公司凈入器材廠）1.2試劑維生素B6片（10mg/片，新疆西域藥業(yè)有限公司，批號10020402）：取20片 稱重，并研磨成粉，備用，計算得藥粉的平均片重為73.93/mg。維生素B6貯備液溶液（195.4 Ug/ml，實驗室提供）鹽酸（0.01mol/ml，實驗室提供）2 方法與結(jié)果2.1方法2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備維生素B2的濃度線性范圍為2 U g/ml-10 U g/ml，儲備液的濃度為194.4 U

6、g/ml。故分別移取 0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.00ml 和 1.25ml 儲備液。 用鹽酸（0.01mol/ml ）稀釋至25ml即得。2.1.2樣品溶液制備平行稱量樣品10.14mg、10.62mg、10.76mg，分別用鹽酸溶液溶解，定 容至25ml容量瓶中，再分別移取3ml稀釋至25ml即得。2.1.3確定激發(fā)、發(fā)射波長根據(jù)UV光譜確定激發(fā)波長入ex和發(fā)射光譜的范圍，固定激發(fā)波長，再選定 范圍掃描發(fā)射光譜；再根據(jù)發(fā)射光譜確定發(fā)射波長入em和激發(fā)光譜的范圍，固 定發(fā)射波長，在選定范圍掃描激發(fā)光譜。最終確定激發(fā)波長與發(fā)射波長。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜圖見圖1、圖2。熒光定量分

7、析維生素鳥的參數(shù)設(shè)定：激發(fā)波長入ex = 290nm，發(fā)射波長入em = 386nm，狹縫寬度（3,3），縱坐標(biāo)擴(kuò)展0-200。2.1.4測量設(shè)定好參數(shù)后，轉(zhuǎn)換進(jìn)入計算模式。重新進(jìn)行空白調(diào)零，分別對5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3次平行檢測。再將樣品溶液過濾后進(jìn)行熒光檢 測，同樣平行測量3次。圖1維生素B6激發(fā)光譜圖2維生素B6發(fā)射光譜2.2.方法學(xué)研究2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別精密量取該維生素B6儲備液（194.4 u g/ml） 0.25、0.50、0.75、 1.00、1.25ml置25ml容量瓶中，加鹽酸溶液（0.01mol/ml）稀釋至刻度，搖 勻，即得系列濃度的對照品溶液，照熒光分光

8、光度法，在上述條件下測定 熒光強(qiáng)度F，分別測3次，取平均值，以熒光強(qiáng)度（F）對濃度（C）回歸處 理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗編號濃度（U g/ml）F1F2F3F （平均值）RSD%11.954158.302157.140157.406157.6160.497123.908266.392265.242263.602265.0791.144535.862398.063395.364392.663395.3632.204547.816455.308453.260450.710453.0931.880959.770524.874524.026521.300523.4121.5247LO

9、GJ16B1U1J濃度 tug/inl)圖3維生素B6的濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線在2ug/ml-10ug/ml濃度范圍內(nèi)，維生素B6的濃度與熒光強(qiáng)度成線 性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：F=47.063C+83.0308，相關(guān)系數(shù)：r=0.9883。2.2.2精密度試驗分別精密量取該維生素B6儲備液(194.4 u g/ml) 0.25、0.5、0.75ml 置25ml容量瓶中，加鹽酸溶液(0.01mol/ml)稀釋至刻度，搖勻即得，照熒 光分光光度法，在上述條件下測定熒光強(qiáng)度F。平行操作3份。表2精密度實驗濃度(ug/ml) 熒光強(qiáng)度F 測定濃度(ug/ml)均值土RSD16.2832.5748.852.

10、2.3回收率實驗分別精密量取維生素B6儲備液(194.4 u g/ml ) 0.25、0.5、0.75ml置25ml容量瓶中，再分別加入1.0ml樣品溶液，加鹽酸溶液(0.01mol/ml ) 稀釋至刻度，搖勻，即得高、中、低三種濃度溶液，濾過，棄去初濾液， 用續(xù)濾液測定熒光強(qiáng)度F,平行操作3份，計算回收率。表3回收率實驗本底值加入量測得值回收率平均值土 RSD高濃度1.954ug/ml2.954ug/ml中濃度3.908ug/ml4.908ug/ml低濃度5.826ug/ml6.826ug/ml2.3.樣品含量測定根據(jù)樣品的標(biāo)示量，取20片維生素B6片置于研缽中研磨，求平均片重， 平行稱量樣

11、品10.14mg、10.62mg、10.76mg，分別用鹽酸溶液溶解，定容至 25ml容量瓶中，再分別精密移取3ml置于25ml容量瓶，用鹽酸(0.01mol/ml ) 定容至刻度，即得樣品溶液，用微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)行測定。表4樣品測得熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)及處理FiF2F3F平均值濃度(ug/ml)計算質(zhì)量(mg)標(biāo)示量417.458417.518415.053416.6767.0891.477107.7418.543415.743414.332416.2067.0791.475102.6448.587448.309446.397447.7647.7521.615110.9計算標(biāo)示量百分含量的RS

12、D%=3.43，平均標(biāo)示量B%=107.1%。藥典規(guī)定 制劑規(guī)格范圍為95%-105%，所以該藥品不合格。3討論溶劑能夠影響熒光效率，改變熒光強(qiáng)度，測定時必須采用同一溶劑， 實驗標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液都采用鹽酸作為溶劑。熒光強(qiáng)度與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：共軛體系越大，離域大，n鍵的電 子越易激發(fā)，熒光越易產(chǎn)生；熒光物質(zhì)的剛性和平面性越強(qiáng)，越有利于 熒光發(fā)射；給電子取代基加強(qiáng)熒光，吸電子取代基減弱熒光。在一定 濃度范圍內(nèi)，隨著溶液濃度增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，超過此范圍，濃度的增 大，熒光強(qiáng)度反而下降，這是由于熒光試劑濃度增大發(fā)生的自猝滅現(xiàn)象。影響熒光強(qiáng)度的因素除了濃度因素外，還有溫度、溶劑、溶液pH、猝滅劑等。樣品在低溫下測定，靈敏度提高，因為介質(zhì)黏度增大，分子間相互碰撞減少；熒光物質(zhì)在不同溶劑中，介電常數(shù)增大入em長移，極性增加，熒光強(qiáng)度增大；pH對酸堿性化合物的熒光強(qiáng)度有很大影響。樣品回收率實驗是對檢測方法學(xué)的考察，目的是衡量檢測器的準(zhǔn)確 性。原理是對檢測液中加入已知量的待測物。測得值減去本底值，從而計 算出加入量。用檢測得到的量比實際的加入量，所得值即為回收率。通常設(shè)定高中低三個劑量組，一般選擇線性范圍內(nèi)的1/3,1/2,2/3處濃度值為檢測量。分別進(jìn)