乳酸羥基乙酸共聚物微泡聲學(xué)造影劑的制備與評(píng)估實(shí)驗(yàn)研究

1、 PAGE 6乳酸羥基乙酸共聚物微泡聲學(xué)造影劑的制備與評(píng)估實(shí)驗(yàn)研究李奇林 全學(xué)模 （重慶400014,重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,）提 要 目的 制備乳酸羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid ,PLGA)微泡聲學(xué)造影劑，考察其理化及聲學(xué)特性。方法 復(fù)乳法制備不同PLA/PGA比例的微泡，考察其理化特性；體內(nèi)外顯影評(píng)價(jià)不同劑量、不同機(jī)械指數(shù)條件下微泡造影劑的聲學(xué)信號(hào)強(qiáng)度變化規(guī)律。結(jié)果 PLGA微泡成品呈白色粉末狀，以生理鹽水或PBS稀釋溶解后為乳白色混懸液；光鏡觀察顯示微泡大小均勻，分散程度好； Coulter計(jì)數(shù)顯示0.01g多聚體微泡凍干粉溶于10ml蒸餾水

2、中的濃度為2l094l09/ml；體外顯影顯示聲學(xué)強(qiáng)度隨微泡濃度的升高而增大，聲學(xué)強(qiáng)度與機(jī)械指數(shù)（Mechanical index, MI）幾乎呈直線關(guān)系。兔心臟造影檢查可觀察到PLGA微泡造影劑能順利通過(guò)肺循環(huán)實(shí)現(xiàn)左心顯影。結(jié)論 PLGA微泡造影劑具有較高的可控性和穩(wěn)定性，微泡共振頻率較高，可以順利通過(guò)肺循環(huán)實(shí)現(xiàn)左心室顯影?！娟P(guān)鍵詞】 聲學(xué)造影劑，乳酸羥基乙酸共聚物，理化性質(zhì)【中圖法分類(lèi)號(hào)】R445.1Experimental Study on poly lactic-co-glycolic acid microbubble ultrasonic contrast agent prepara

3、tionLi Qilin Quan Xuemo (Childrens Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400014,China) Abstract Objectives To Prepare PLGA microbubbles and evaluate its physicochemical and acoustic properties.Methods We prepared PLGA microbubbles by HYPERLINK javascript:showjdsw(jd_t,j_) double emulsio

4、n method .We examined its physicochemical properties and evaluated its acoustic properties in vitro under different doses with ultrasound energy at a variety of MI values. Result PLGA microbubbles were white powder and HYPERLINK /dict_result.aspx?searchword=%e4%b9%b3%e7%99%bd%e8%89%b2&tjType=sentenc

5、e&style=&t=ivory ivory suspension dissolved in saline or PBS. Under microscope, microbubbles had uniform sizes and good dispersion. The microbubble suspension contained 2.01094.0109 /ml microbubbles per 1mg/ml. The vitro study showed that acoustic intensity increased with PLGA microbubbles concerntr

6、ation and changed with MI linearly. We observed that PLGA microbubbles had passed through pulmonary circulation and achieved left ventricular imaging in vivo. Conclusion PLGA microbubbles had an ideal controllability in preparation, outstanding stability and higher resonance frequency. The agents co

7、uld successfully passed through pulmonary circulation and achieved left ventricular imaging. Key words ultrasound contrast agent; poly lactic-co-glycolic acid; physicochemical properties 通信作者 李奇林，E-mail: chenhj_乳酸羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid, PLGA）是獲得FDA批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床的生物醫(yī)用材料，組織相容性好，可以在體內(nèi)完全降解和代謝消失，

8、無(wú)免疫原性及潛在的交叉感染危險(xiǎn)。因此近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始探索應(yīng)用PLGA作為新型的微泡造影劑包膜材料。良好的聲學(xué)造影劑不但需要具有優(yōu)越的散射性能，還要求微泡可通過(guò)肺組織毛細(xì)血管網(wǎng)，并能在循環(huán)中保持一定的穩(wěn)定性。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用復(fù)乳法制備PLGA微泡，并考察其基本理化及聲學(xué)特性。1 材料和方法1.1 主要試劑與儀器 PLGA ( 50:50,65:35,90:10, 100:0相對(duì)分子質(zhì)量15000)；聚乙烯醇(PVA，平均相對(duì)分子量37萬(wàn))；二氯甲烷、異丙醇、氯化鈉等試劑均為分析純；GE VIVI7彩色超聲診斷儀；VC500超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；BP221s型電子天平；88-1定時(shí)恒溫磁力攪拌器

9、；LGJ-25立式凍干機(jī)； KUBOTA 6930高速冷凍離心機(jī)；MS II型庫(kù)爾特顆粒分析儀； HITACHI S-3000N掃描電鏡；Mettler-Toledo Delta 320 PH計(jì)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)；DFY- II型超聲圖像定量分析診斷儀；LS230激光粒度分析儀。 1.2 主要液體配制5%PVA溶液：精密稱(chēng)取25gPVA顆粒置于燒杯中，加入超純水500ml，微波爐反復(fù)加熱、冷卻、攪拌直至完全溶解，冷卻后紗布過(guò)濾裝瓶備用，應(yīng)用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔4只，雌雄不限，體重2.53 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，速眠

10、新 = 2 * ROMAN II肌注麻醉，剃須刀進(jìn)行前胸部脫毛。1.4 PLGA微泡的制備通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，篩查出在微球制備過(guò)程中超聲乳化強(qiáng)度、時(shí)間、攪拌速度等因素對(duì)微泡的粒徑及分布有較大影響。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì) W/O/W乳液溶劑揮發(fā)法的工藝流程中的上述參數(shù)進(jìn)行單因素考察，選擇最適參數(shù)以調(diào)節(jié)微泡粒徑在適宜范圍。精密稱(chēng)取0.25gPLGA置入的5ml二氯甲烷溶液中，振蕩使之充分溶解；在上述溶液中加入適量蒸餾水，超聲細(xì)胞破碎儀(功率160W)冰浴下充分乳化(乳化時(shí)間90s)制得初乳液，倒入3%PVA溶液中再次勻化后，加入到同濃度的PVA溶液中持續(xù)攪拌(轉(zhuǎn)速600rpm)，并加入一定量2%異丙醇萃取有機(jī)

11、溶劑, 待二氯甲烷完全揮發(fā), 微球固化后，蒸餾水反復(fù)離心洗滌數(shù)次，收集沉淀加入適量蒸餾水真空冷凍干燥即得PLGA微泡凍干粉。1.5 PLGA微泡基本特性的考察 將所得凍干粉用PBS溶解稀釋到一定比例后， Leica光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)觀察所得的微泡的外觀形態(tài)、大小分布及分散度等性質(zhì)并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。激光粒度儀測(cè)定微泡粒徑大小及其分布，Coulter計(jì)數(shù)儀進(jìn)行濃度測(cè)定。酸度計(jì)測(cè)定PLGA微泡懸液的PH值。將冷凍干燥的PLGA微泡噴金， HITACHI S-3000N 掃描電鏡觀察微泡的表面情況。1.6 PLGA微泡初步穩(wěn)定性測(cè)試 制作不同PLGA比例

12、(5050，6535，9010,100:0)微泡，將成品以凍干粉及混懸液(0.15M PBS配置)的形式分別貯存于常溫及4下，于第12h、24h、48h、96h、1w、2w、6w、10w取樣品，光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)外觀，并測(cè)定微泡的濃度、PH值、粒徑及分布。1.7 PLGA微泡體外顯影 將一定量的PLGA凍干粉末溶于PBS (25 0C，PH7.4)溶液500ml, 配置3種不同劑量(1.2mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml)的微泡混懸液并倒入水槽。將水槽放置在一磁振子攪拌器上, 保持轉(zhuǎn)速60rpm以防止微泡沉降。采用GE VIVI7超聲診斷儀，10L線陣探頭 (頻率4.9/9.9M

13、Hz)，調(diào)節(jié)超聲輸出強(qiáng)度MI在0.031.2范圍變化，儀器其他參數(shù)設(shè)置在實(shí)驗(yàn)中保持不變。比較不同劑量的造影劑在不同MI條件下灰階信號(hào)強(qiáng)度變化,檢測(cè)造影前后微泡的濃度及粒徑變化。各實(shí)驗(yàn)組取3批次不同樣品平行進(jìn)行3次(n9)。磁盤(pán)存圖后轉(zhuǎn)為jpg格式，錄像轉(zhuǎn)為AVI格式。采用DFY- II型超聲圖像定量?jī)x圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，將感興趣區(qū)設(shè)定為正方形，大小40010像素，采樣區(qū)域保持在同一深度。 1.8心臟超聲造影 稱(chēng)取PLGA微泡凍干粉0.2g溶于10ml生理鹽水,配制成濃度為0.02g/ml的微泡混懸液。新西蘭大白兔4只，應(yīng)用速眠新 = 2 * ROMAN II 0.02mg/kg肌注麻醉后

14、，使其仰臥于檢查床，充分暴露前胸部。采用GE VIVI7超聲診斷儀進(jìn)行體內(nèi)顯影效果的觀察，比較不同MI (0.2、0.6、1.0、1.2)條件下的心臟造影成像效果。超聲掃查選用M3S探頭(發(fā)射頻率1.7MHz，接受頻率3.4MHz)，采用連續(xù)成像方式，成像深度5cm，取心尖四腔心切面，記錄基礎(chǔ)狀態(tài)下圖像,待圖像滿意后經(jīng)耳緣靜脈注射造影劑(0.05ml/kg)，隨后推注10ml生理鹽水。觀察造影劑充盈時(shí)段并存圖，工作站轉(zhuǎn)存圖片為jpg格式,定量?jī)x分析圖片，指標(biāo)分析時(shí)取樣框置于同一深度，分別選取3個(gè)感興趣區(qū)，結(jié)果取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ eq oac(-,x)）表示

15、，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，組間比較采用t檢驗(yàn)，P0.05認(rèn)為差異有顯著性意義，P0.5，體外顯影可獲得較明顯的灰階圖像;在MI1.0以后，PLGA微泡聲學(xué)信號(hào)強(qiáng)度隨MI增高的上升幅度減小 (表1)。定量分析微泡懸液隨時(shí)間的回聲強(qiáng)度變化，結(jié)果顯示濃度0.6mg/ml的微泡懸液在MI 0.6的診斷超聲照射6min后，平均聲學(xué)強(qiáng)度下降1.79dB(表2)。超聲照射前后微泡濃度及粒徑無(wú)顯著性差異（P0.05）。MIDose0.3 0.6 1.20.030.68士0.07 0.76士0.081.15士0.120.061.13士0.101.26士0.183.09士0.370.122.37

16、士0.203.45士0.224.51士0.450.245.87士0.776.46士0.458.45士0.490.37.92士1.188.43士0.6411.27士0.660.410.37士1.5211.65士0.9113.63士0.860.512.70士1.5614.43士1.1117.35士1.320.617.33士1.7220.56士1.3824.08士1.420.820.39士2.0123.77士1.8328.01士1.87123.53士2.0727.23士2.1631.76士2.081.124.55士2.4428.09士3.2632.56士3.231.225.03士2.7128.75士

17、3.6433.57士3.78表1不同劑量和機(jī)械指數(shù)條件下顯影的結(jié)果分析( eq oac(-,x) 表2 PLGA微泡懸液時(shí)間強(qiáng)度定量分析結(jié)果( eq oac(-,x)Time (min)0246Enhancement (dB)20.52士0.3419.94士0.5219.26士0.8118.73士1.072.5心臟造影結(jié)果分析諧波狀態(tài)下視覺(jué)觀察，在較低機(jī)械指數(shù)(MI 0.2)，心室顯影淺淡，隨著MI的增大，心室顯影逐漸增強(qiáng)。造影劑推注后首先出現(xiàn)右房及右室顯影(圖2)，左室顯影出現(xiàn)在右室顯影后1-3個(gè)心動(dòng)周期(圖3)。定量分析不同MI造影下左室心腔內(nèi)聲學(xué)密度(acoustic density,

18、AD)變化，結(jié)果顯示當(dāng)MI為0.2時(shí)，左室內(nèi)AD值較其他三組均有非常顯著性差異，如表3所示。MI0.20.61.01.2AD16.82.426.23.7#28.33.6#29.73.2#表3 不同機(jī)械指數(shù)(MI)左室心腔造影定量分析(單位dB) #與MI 0.2比較，P0.01圖2心臟造影成像，右房右室顯影圖3心臟造影成像，左室基本充盈 3 討 論血管內(nèi)超聲造影劑已有30多年的研究歷程，自Feinstein SB等addin 0000088300002Microbubble dynamics visualized in the intact capillary circulation.J Am

19、 Coll Cardiol JT - Journal of the American College of Cardiology1984Feinstein SB;Shah PM;Bing RJ;Meerbaum S;Corday E;Chang BL;Santillan G;Fujibayashi Y43595-600SepUNITED STATES1應(yīng)用聲振法制備白蛋白微泡造影劑后，研究者逐漸增多，聲學(xué)造影劑發(fā)展突飛猛進(jìn)，超聲造影診斷水平有了質(zhì)的飛躍，極大地拓寬了聲學(xué)造影的應(yīng)用范圍addin 10000092500002Efficacy and safety of the novel ult

20、rasound contrast agent perflutren (definity) in patients with suboptimal baseline left ventricular echocardiographic images.Am J Cardiol2000Kitzman DW;Goldman ME;Gillam LD;Cohen JL;Aurigemma GP;Gottdiener JS866669-74Sep 15UNITED STATESThe American journal of cardiology0000092800002Diagnostic efficac

21、y of SonoVue.Am J Cardiol2000Bokor D864A19G-24GAug 17UNITED STATESThe American journal of cardiology2, 3。超聲造影劑的種類(lèi)繁多，制備方法也多種多樣，常用的包括機(jī)械勻化法、聲振空化法以及新型的噴射霧化法等addin 20000088600002Influence of environmental conditions on a new surfactant-based contrast agent: ST68.Ultrasound Med Biol2000Basude R;Duckworth

22、JW;Wheatley MA264621-8MayENGLANDUltrasound in medicine & biology0000088700002Evaluation of synthetic phospholipid ultrasound contrast agents.Ultrasonics2002Hasik MJ;Kim DH;Howle LE;Needham D;Prush DP409973-82NovNetherlandsUltrasonics0000088500002Fundamental studies on contrast images from different-

23、sized microbubbles: analytical and experimental studies.Ultrasound Med Biol2000Soetanto K;Chan M26181-91JanENGLANDUltrasound in medicine & biology4-9。乳化溶劑揮發(fā)法制備緩釋微球是一個(gè)已經(jīng)成熟應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法，本實(shí)驗(yàn)中我們以去離子水為內(nèi)水相，采用(W/O/W)乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA微泡，基本原理是將聚合物溶于有機(jī)溶劑，與內(nèi)水相混合振蕩攪拌形成微球，隨著初乳中溶劑的揮發(fā)，形成外部為PLGA固化膜，內(nèi)部為氣核的微泡addin 100000892000

24、02Preliminary study of oral polylactide microcapsulated insulin in vitro and in vivo.Diabetes Obes Metab2000Ma XY;Pan GM;Lu Z;Hu JS;Bei JZ;Jia JH;Wang SG24243-50AugEnglandDiabetes, obesity & metabolism0000089300002A method for the preparation of polymeric nanocapsules without stabilizer.J Control Re

25、lease1999Lu Z;Bei J;Wang S611-2107-12Aug 27NETHERLANDSJournal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society10, 11。由于微泡外殼與內(nèi)核的聲阻抗率差異明顯，具有極高的衰減系數(shù)，因而成為可在超聲波下產(chǎn)生不同于均勻媒質(zhì)的傳播性質(zhì)，對(duì)超聲探測(cè)信號(hào)產(chǎn)生很強(qiáng)散射信號(hào)。復(fù)乳法制備PLGA微泡受到多個(gè)環(huán)節(jié)因素的影響addin 0000093700002Development of a novel method for synthesis of

26、 a polymeric ultrasound contrast agent.J Biomed Mater Res A2003El-Sherif DM;Wheatley MA662347-55Aug 1United StatesJournal of biomedical materials research. Part A12，在預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中我們考察了改變制備參數(shù)對(duì)微泡性質(zhì)的影響，結(jié)果顯示調(diào)節(jié)某些制備參數(shù)能夠很好的控制粒徑大小，較好地滿足聲學(xué)造影的要求。在所有的影響因素中，超聲乳化強(qiáng)度占主導(dǎo)地位，聲振強(qiáng)度直接影響生成的初乳乳滴的粒徑大小。增強(qiáng)超聲乳化功率或延長(zhǎng)乳化時(shí)間，可使初乳更均勻，微球粒徑

27、減小，同時(shí)分布更趨集中。功率過(guò)低或乳化時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致微球形態(tài)不佳，但功率大于160W后，微球質(zhì)量改善則不明顯。乳化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可造成有機(jī)溶劑的過(guò)多揮發(fā)，影響初乳穩(wěn)定性，因此乳化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。由于改變液滴粒徑的大小，須克服液滴內(nèi)外壓差，提高復(fù)乳的攪拌速率可以提供更大的剪切力，故拌速率越高，所制得的微泡粒徑越小。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制制備過(guò)程中超聲乳化的功率、時(shí)間及復(fù)乳的攪拌速度可以較好的調(diào)節(jié)微泡的粒徑、分布及外殼厚度，可以達(dá)到改變微泡造影劑的聲學(xué)特性的目的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)PLGA微泡進(jìn)行了初步的體外穩(wěn)定性研究，研究時(shí)間最長(zhǎng)為10周，結(jié)果表明在40C及常溫干燥儲(chǔ)存條件下PLGA微泡具有很好的穩(wěn)定性，再分散

28、后理化性質(zhì)無(wú)明顯變化，仍可很好的滿足造影需求。微泡置于PBS或生理鹽水中保存時(shí)，則很快會(huì)因聚合物的水解失重而改變理化特性，因此聚合物微泡在實(shí)際使用過(guò)程中應(yīng)盡量干燥保存，以防止其降解。Straub JA等addin 10000090500002Porous PLGA microparticles: AI-700, an intravenously administered ultrasound contrast agent for use in echocardiography.J Control Release2005Straub JA;Chickering DE;Church CC;Shah

29、 B;Hanlon T;Bernstein H108121-32Nov 2NetherlandsJournal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society0000093900002Porous PLGA microparticles: AI-700, an intravenously administered ultrasound contrast agent for use in echocardiography.J Control Release2005Straub JA;Chicke

30、ring DE;Church CC;Shah B;Hanlon T;Bernstein H108121-32Nov 2NetherlandsJournal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society9應(yīng)用噴霧干燥法制備了包裹氟碳?xì)怏w的PLGA微泡，平均直徑2.3m，研究顯示在MI 1.6的高能超聲照射下20min下微泡仍能穩(wěn)定存在，未觀察到有明顯的微泡崩解，照射前后微泡粒徑及濃度無(wú)明顯差異，研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相一致，提示PLGA作為組成微泡表面的包膜材料，分子間作用力較強(qiáng)，表面張力低，體外穩(wěn)

31、定性好，造影持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，抗壓性能優(yōu)越，可較好的滿足臨床造影成像的要求。本實(shí)驗(yàn)體外顯影顯示PLGA微泡在MI1.0后聲學(xué)信號(hào)強(qiáng)度隨MI增大上升幅度逐漸降低。上述結(jié)果表明PLGA微泡不適宜低機(jī)械指數(shù)成像,而在MI 0.61.0范圍內(nèi)成像效果較為理想。心臟造影實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示較低機(jī)械指數(shù)(MI 0.22)下心室顯影淺淡，隨著MI增加，多聚體造影劑造影增強(qiáng)效果逐漸升高，當(dāng)MI 1.2時(shí)左心室腔可觀察到明顯的增強(qiáng)顯像，推測(cè)可能是由于PLGA微泡外殼較硬，需要較高的聲壓作用才能得到微泡的非線性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的背向散射信號(hào)。Wheatley MAaddin 0000093800002Comparison of in

32、vitro and in vivo acoustic response of a novel 50:50 PLGA contrast agent.Ultrasonics2006Wheatley MA;Forsberg F;Oum K;Ro R;El-Sherif D444360-7NovNetherlandsUltrasonics13等制備并考察了PLGA微泡造影劑的聲學(xué)特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)微泡的體外共振頻率較同等直徑的游離氣泡低，提示微泡的外殼構(gòu)成是影響其聲學(xué)性質(zhì)的重要因素。Dalia M等addin 0000093400002Ultrasound degradation of novel pol

33、ymer contrast agents.J Biomed Mater Res A2004El-Sherif DM;Lathia JD;Le NT;Wheatley MA68171-8Jan 1United StatesJournal of biomedical materials research. Part A14研究了超聲頻率(5 MHz10MHz)對(duì)PLGA微泡超聲造影劑降解的影響，發(fā)現(xiàn)微泡降解的模式與微泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在微泡處于其共振頻率時(shí)散射最強(qiáng)，聲學(xué)效果最明顯，微泡降解速率也最快，這對(duì)于今后指導(dǎo)超聲觸發(fā)的藥物控釋具有重要意義。綜上所述，PLGA微泡符合聲學(xué)造影劑的基本要求，

34、具有良好的開(kāi)發(fā)前景，有望成為一種具有優(yōu)越臨床應(yīng)用價(jià)值的超聲微泡造影劑。隨著技術(shù)的發(fā)展，高分子多聚體微泡外殼的設(shè)計(jì)將越來(lái)越趨于個(gè)性化，或許可以為某種病理狀態(tài)所需的成像條件量身定做適合的造影劑。 參考文獻(xiàn)1Feinstein SB, Shah PM, Bing RJ, et al. Microbubble dynamics visualized in the intact capillary circulationJ. J Am Coll Cardiol JT - Journal of the American College of Cardiology,1984,4(3):595-600.2Ki

35、tzman DW, Goldman ME, Gillam LD, et al. Efficacy and safety of the novel ultrasound contrast agent perflutren (definity) in patients with suboptimal baseline left ventricular echocardiographic imagesJ. Am J Cardiol, 2000,86(6):669-74.3Bokor D. Diagnostic efficacy of SonoVueJ. Am J Cardiol, 2000,86(4

36、A):19G-24G.4Basude R, Duckworth JW, Wheatley MA. Influence of environmental conditions on a new surfactant-based contrast agent: ST68J. Ultrasound Med Biol, 2000,26(4):621-8.5Hasik MJ, Kim DH, Howle LE, et al. Evaluation of synthetic phospholipid ultrasound contrast agentsJ. Ultrasonics, 2002,40(9):973-82.6Soetanto K, Chan M. Fundamental studies on contrast images from different-sized microbubbles: analytical and experimental