ELISPOT技術(shù)原理及其操作

1、ELISPOT技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cellmediatedimmuneresponse,CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究細(xì)胞免疫應(yīng)答保護(hù)作用及其機(jī)理方面，有多種研究方法可以使用，如：ELISA(酶標(biāo)記免疫附測(cè)定法，enzyme-linkedimmunosorbentassay)、流式細(xì)胞分析術(shù)(flowcytometry)、定量RT-PCR以及這里要介紹的近年使用越來越多的ELISPOTo作為一項(xiàng)新型的免疫酶技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)

2、,是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞(ASC)或分泌細(xì)胞因子(CK)細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技札由于該方法敏感性高，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè)定中。下面將從原理、具體實(shí)驗(yàn)操作、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用幾方面進(jìn)行介紹。原理ELISPOT就其原理來說實(shí)在是很簡單的，從本質(zhì)上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難，關(guān)TELISA的工竹二原理可看爾聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)【1】。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。如圖所示，反應(yīng)步驟可大致分為：利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體

3、包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合洗掉細(xì)胞利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合洗掉細(xì)胞加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過底物的顯色反應(yīng)，一個(gè)細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn),CaptureAntibodyhr沁andFNmCoilmcizdbwithJiriiytridnolureunUUx/FcrKrtGototcpSaBpl-rdarctnira.BbckingBl

4、ocktinoccupied*1(kwithfrotfilnVYYYVYY3AddCellsnojbatflcalkinvwllwithAsUTiulufisU.4WashwaJwdoff5DeteciranAntibodyAddBotinbtcJanticytolcmodolocticnantibed;75DeteciranAntibodyAddBotinbtcJanticytolcmodolocticnantibed;7DevelopWithSubstrataAdimjtatrata“ndnonltorfonTtjcnofuotorodipoti最后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)(reader

5、)就可以計(jì)算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目以上是檢測(cè)分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測(cè)分泌特異抗體的細(xì)胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘惶禺惪乖纯?。具體實(shí)驗(yàn)操作從原理上看ELISPOT的確很簡單，但是在操作過程中有許多條件需耍摸索，所以這里進(jìn)一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4C孵育過夜。將板用PBS洗6遍,再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少lhoFCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個(gè)細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定

6、抗體，這樣使最后的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞靈敏度成為可能。同時(shí)，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA的不同之處。理論上是可以同時(shí)包被兩個(gè)不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就?？紤]到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量耍足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。將陰性對(duì)照和細(xì)胞樣品,如外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，經(jīng)純化的CDUT細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC,用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5X10*2X10個(gè)/孔如果條件可以達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3X105-5

7、X10MVA,特別是在分泌細(xì)胞)，分裝TELISP0T板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達(dá)產(chǎn)物,提取的抗原等，陰性對(duì)照孔中只加入培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)中最好采用無血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因?yàn)檠迮尾煌牟町愃斐傻恼`差，同時(shí)也避免血清的某些成份會(huì)引起非特異的反應(yīng))，陽性對(duì)照孔加入植物血凝素(PHA,2ug/mL)或陽性多肽,379,體積比為5%W培養(yǎng)2448h。要進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測(cè)是十分靈敏的，頻率低至10的分泌細(xì)胞都可以被檢測(cè)出來。并且對(duì)丁那些會(huì)貼壁的細(xì)胞也可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長貼壁后不易被洗去，但是不會(huì)妨礙最后斑點(diǎn)的顯色。

8、只耍細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)逐步擴(kuò)散到細(xì)胞四周，最后還是可以顯示出斑點(diǎn)。用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素,室溫孵育3ho用PBS-Tween-20再洗5次，加入底物室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色（AKP和底物的產(chǎn)物）或紅色（HRP和底物的產(chǎn)物）斑點(diǎn)時(shí)，即可用立體解剖顯微鏡或計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，并用斑點(diǎn)形成單位（sfu/L百萬加入細(xì)胞）記錄結(jié)果。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測(cè)定，這時(shí)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌特異

9、抗體的細(xì)胞。完成了以上步驟后其實(shí)只是完成了實(shí)驗(yàn)的一半。在你不斷摸索反應(yīng)的條件之后，得到了一塊布滿斑點(diǎn)的板，接下來耍如何對(duì)這些斑點(diǎn)進(jìn)行分析呢。如果利用顯微鏡人工技術(shù)無疑是太參有個(gè)人因素的實(shí)驗(yàn)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定會(huì)被審稿人好好質(zhì)疑一番。隨后，有人使用數(shù)碼相機(jī)拍攝下來后，使用photoshop進(jìn)行處理、計(jì)數(shù)，這種方法也存在較多的個(gè)人因素。一項(xiàng)技術(shù)耍普及，為廣大研究人員所接受，就必需盡量減小人為的誤差。所以，近年許多公司開始開發(fā)計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)，使用系統(tǒng)設(shè)定的閾值對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行人工智能計(jì)數(shù)。這樣，由計(jì)算機(jī)將陰性對(duì)照中非特異反應(yīng)斑點(diǎn)進(jìn)行去除，同時(shí)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)一計(jì)數(shù)，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果置信度便大大提升了。目前判斷的首

10、耍標(biāo)準(zhǔn)還是斑點(diǎn)的大小，但是做過電泳、同位素等的計(jì)算機(jī)成像的研究人員都遇到過一個(gè)問題：很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)產(chǎn)生一些較淡的斑點(diǎn)，用肉眼判斷絕對(duì)是背景。所以在設(shè)計(jì)軟件時(shí)也必需考慮到斑點(diǎn)深淺因素。計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，這項(xiàng)技術(shù)的成熟相信會(huì)使ELISP0T的應(yīng)用范圍更加擴(kuò)寬。技術(shù)優(yōu)勢(shì):ELISPOT的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),這項(xiàng)技術(shù)可用丁檢測(cè)并計(jì)數(shù)單個(gè)抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟,1983年,Czerkinsky等采用此法檢測(cè)

11、脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡便易行。后來，他們乂用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2Y的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌其他細(xì)胞因子(如IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,TNFa和IL-6)數(shù)量的手段也被建立起Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性，He用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)H動(dòng)分析TNF2a酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的大小和數(shù)量，計(jì)算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞(PBMC)中抗原特異性CDJT細(xì)胞的數(shù)

12、量，不但提高了對(duì)背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能oVaquerano等將數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)結(jié)合起來，開發(fā)出類似的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點(diǎn)數(shù)大丁-100時(shí)，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時(shí)間。隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢(shì)也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對(duì)比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在。與ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量oELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可H接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過計(jì)算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌

13、該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅耍測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率)由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。與有限稀釋法(limitingdilutionanalysis,LDA)LDA能夠?qū)μ禺愋訡TL細(xì)胞進(jìn)行定量，曾在很多年中被認(rèn)為是CTL檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorialCTL,mCTL)亞群的細(xì)胞周期。但該方法需耍高強(qiáng)度抗原刺激，這會(huì)加快效應(yīng)

14、CTL(eCTL)凋亡，且不能定量測(cè)定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測(cè)定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間可長達(dá)23周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。與四聚體法(Tetramer)最近兒年出現(xiàn)了MHC2I類分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢(shì)在丁迅速、氏接、靈敏且特異性強(qiáng)，即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低丁7%,用MHC2I抗原肽四聚體法仍可虛接測(cè)到準(zhǔn)確的值，比LDA敏感度耍高510倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCI類分子的技術(shù)困難外，最主耍缺點(diǎn)是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位，而MHCI類分子結(jié)合的各種表位,能否形成CTL反應(yīng)，卻隨著基因背景及時(shí)間的變化而變化,因此選擇正確的

15、表位就顯得尤為重耍。優(yōu)勢(shì)表位的篩選可以通過Elispot來進(jìn)行，但對(duì)整個(gè)肽庫進(jìn)行掃描,并不是一件很容易的事。當(dāng)然,生物信息學(xué)的運(yùn)用對(duì)表位的篩選有很大的幫助。同時(shí)，有研究結(jié)果表明，并非所有經(jīng)過Tetramer鑒定的陽性細(xì)胞都有確切的功能，Tetramer陽性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2Y細(xì)胞數(shù)的10倍,其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞，可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時(shí)測(cè)定其功能很重要。與C尹釋放法此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測(cè)CTL識(shí)別的抗原多樣性方而非常有效,且能精確闡明被CTL識(shí)別的最佳表位，但至多為半定量的層面，而且CF標(biāo)記

16、細(xì)胞的H發(fā)釋放率較高，不適丁較長時(shí)間培養(yǎng)；標(biāo)記時(shí)所需的細(xì)胞濃度較高，因而給試驗(yàn)帶來諸多不便；此外,CF釋放法所測(cè)定的是一個(gè)細(xì)胞群體的特性，而不是單個(gè)細(xì)胞。與胞內(nèi)CK染色法與ELISPOT法相比較，胞內(nèi)CK染色法(intra-cellularCKstaining,ICS)主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法，是檢測(cè)循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T淋巴細(xì)胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測(cè)所有分泌CK的eCTLo廨用目前，ELISPOT已被用丁檢測(cè)藥物、化學(xué)制劑及其它CK復(fù)合物的特性及功能等方面，因此為體內(nèi)免疫功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)提供了檢測(cè)依據(jù)。近兒年來，ELISPOT技術(shù)在腫瘤疫苗評(píng)

17、價(jià)試驗(yàn)、免疫監(jiān)測(cè)及免疫學(xué)研究中越來越被廣泛地使用。在抗腫瘤免疫及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用在許多研究中，該技術(shù)已被用丁免疫動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞中抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的數(shù)量檢測(cè)。近期,ELISPOT技術(shù)已用丁分析和評(píng)價(jià)從傳染病病人的PBMC中檢測(cè)肽特異的T淋巴細(xì)胞以及在癌癥病人中誘導(dǎo)腫瘤特異的T細(xì)胞的疫苗試驗(yàn)。ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)敏感性、特異性和可重復(fù)性都很高,操作簡單迅速，需耍少量標(biāo)本，在檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)也反應(yīng)其功能，并與臨床結(jié)果相關(guān)。ELISPOT平板可以提前大量準(zhǔn)備,移液、洗板和讀板都可H動(dòng)化，因而大批量檢査也可做到快速高效。在與與其他方法的比較后,ELISPOT很

18、可能成為定量分析腫瘤或病毒特異性的T細(xì)胞反應(yīng)的首選。在抗感染免疫中的應(yīng)用CTL在抗病毒感染的免疫應(yīng)答中占有主耍地位，而CD4輔助性T細(xì)胞亞群Thl/Th2的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重耍的作用。在HIV研究方面，由MHC-1類分子加工的不同抗原經(jīng)CTL識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答在控制HIV-1感染中同樣起重耍作用。利用ELISPOT方法檢測(cè)CK如IFN2Y就可以進(jìn)一步了解到針對(duì)HIV特異的CTL應(yīng)答及相關(guān)免疫信息。此外,ELISPOT法還用丁評(píng)價(jià)由HIV-1感染引起粘膜的CD4T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及HIVgp120g與霍亂毒素共表達(dá)的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中,ELISPOT還用來檢測(cè)通過H腸免疫低劑量甲肝疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性的鬥限性肝炎中，以Thl為主的應(yīng)答促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發(fā)展方而有重耍作用。在許多抗細(xì)菌免疫研究中，該方法也發(fā)揮了重要作用。例如：應(yīng)用ELISPOT試驗(yàn)證實(shí)表達(dá)大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗(rBCG.MalE)誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是CD4T細(xì)胞依賴的,rBCG.MalE誘導(dǎo)的特異CD4P細(xì)胞應(yīng)答存在Thl/