重組人生長激素USP35

1、重組人生長激素FPTIPLSRLFDNMLRAHRLHQLAFDTYQEKYSFLQPQTSLCFSESIPTPSNRBETQQKSNLELLF.ISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR-LEDGSPRTGCIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKWGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFC990H1528N262O300S722，125口2629-。1-5.胺溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5。胰蛋白酶溶液一用Tris緩沖液制備 1mg/ml胰蛋白酶溶液，混勻，如有必要， 冷凍保存。標(biāo)準(zhǔn)溶液一用Tris緩沖液制備2

2、.0mg/ml USP重組人生長激素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。取1ml 置于適當(dāng)容器中，添加30四1胰蛋白酶溶液， 扣蓋，置于37水浴4小時。注意：如不 立即上樣，置于冰箱中保存。供試溶液一用Tris緩沖溶液制備時間（min）溶液A（%）溶液8（%）洗脫0 - 20100 今 800今20線性洗脫20 - 4080 今 7520 今 25線性洗脫40 - 6575 今 5025 今 50線性洗脫65 - 7050 今 2050 今 80線性洗脫70 - 7120 今 10080今0線性洗脫71 - 861000等度，再平衡重組人生長激素是一種191個氨基酸殘 基組成的由人垂體產(chǎn)生具有促生長作用的 蛋白質(zhì)。

3、可通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)其凍干粉 和水溶劑。其凍干粉制劑中含量應(yīng)不少于 910四g/mg重組人生長激素。其水溶劑每mg 總蛋白量中含重組人生長激素應(yīng)不少于 910明。重組人生長激素中的宿主細(xì)胞DNA 和宿主細(xì)胞蛋白殘留限度標(biāo)準(zhǔn)需經(jīng)被驗證 的方法確認(rèn)。生產(chǎn)企業(yè)必須采用基于促生長 且經(jīng)主管部門認(rèn)可批準(zhǔn)的經(jīng)驗證的生物測 定方法證明其生物效價，可包含其賦形劑。 注：每mg無水重組人生長激素相當(dāng)于3.0 USP單位包裝和貯存一密封容器中-10-25 C儲存。 標(biāo)簽一標(biāo)簽應(yīng)注明重組DNA起源。USP參照標(biāo)準(zhǔn)11USP內(nèi)毒素RS; USP重組人生長激素RS 鑒別一A：取適量USP重組人生長激素標(biāo)準(zhǔn)品， 用稀釋

4、液配制成濃度為2.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶 液。其余參照色譜純度檢查項下進(jìn)行，用色 譜程序分析標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試溶液：供試溶 液色譜圖中重組人生長激素主峰保留時間 應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致。B：肽圖（參見生物制品檢測方法1047） 溶液A一制備三氟乙酸水溶液（1:1000, v/v），過濾，脫氣。溶液B量取100ml水加到1000ml容 量瓶中，再加1ml三氟乙酸，最后用乙腈溶 液稀釋至終體積，并混勻。流動相一溶液A和溶液B的變量混合液 為色譜系統(tǒng)流動相。必要時可調(diào)整任一溶液。（參見色譜系統(tǒng)適應(yīng)性621）Tris緩沖液一配制0.05Mtris（羥甲基）甲2.0mg/ml 重組人生長激素溶液，混勻。取 1ml

5、置于適當(dāng)管內(nèi)，加30gl胰蛋白酶溶液， 扣蓋置于37水浴4小時。注：如不立即 上樣，置于冰箱中保存。色譜分析系統(tǒng)（參見色譜分析方法6217）配備 214nm 檢測波長，4.6mmX 25cm色譜柱，包括填充 L7，流速為 1ml/min，溫度30。色譜分析程序如下：方法一注:色譜系統(tǒng)條件在上樣之前優(yōu) 先運行空白梯度洗脫程序分別進(jìn)樣相同體 積（約100W）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試溶液， 記錄色譜圖：供試溶液色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜 圖相似。生物鑒定一生物鑒定實驗可依據(jù)重組人生 長激素原料藥或其制劑執(zhí)行緩沖液一配制0.1M碳酸氫銨溶液，用 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0。標(biāo)準(zhǔn)溶液一取適量USP重組人生長激 素標(biāo)準(zhǔn)品

6、，用緩沖溶液溶解并稀釋制成濃度 為10100pg/ml溶液。供試溶液用緩沖溶液溶解重組人生 長激素并稀釋至于標(biāo)準(zhǔn)溶液相似濃度。注： 輕輕旋轉(zhuǎn)，不可震動混勻空白對照溶液一緩沖溶液。實驗動物一選擇一定數(shù)量單一雌性或 單一雄性的25到30天大腦垂體切除的斯普 拉格-杜勒鼠。小鼠垂體切除后，飼喂鼠糧和5%葡萄糖溶液超過7小時。72小時后， 飼喂小鼠鼠糧和用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0 + 0.25的已過濾去離子水。從第37到44天對 小鼠稱重，僅記錄健康小鼠體重，7天以后 再次稱重，選擇其中健康且在7天周期內(nèi)體 重增減不超過10%的小鼠。方法一隨機(jī)將上述小鼠分為空白組，對 照組和測試組，每組10只。每天分

7、別對空 白組，對照組和測試組注射0.1ml的空白液， 標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液，共10天。記錄每只 小鼠在實驗開始和第10天注射18小時后的 體重。運用統(tǒng)計學(xué)方法計算供試組相對標(biāo)準(zhǔn) 組10天周期內(nèi)體重變化差異。計算每mg 相當(dāng)USP重組人生長激素活力單位：結(jié)果每 mg應(yīng)不少于2個單位。相對效力95%的對 數(shù)評價置信區(qū)間寬度（L）。L不大于0.40， 效力置信極限應(yīng)符合63%-158%之間。若L 大于0.40，重復(fù)該實驗倆次或多次，結(jié)合適 當(dāng)統(tǒng)計分析方法直至滿足此規(guī)范。微生物限度檢測61 和特定微生物檢測62 精確稱取0.2到0.3g樣品進(jìn)行檢測，好氧 微生物總數(shù)不得超過300cfu/g。細(xì)菌內(nèi)毒素8

8、5每mg不超過10USP EU。 水分，方法Ic921不超過10%，以凍干 粉供試。色譜純度檢查一稀釋液一制備0.05MTris溶液，用鹽酸 調(diào)pH至7.5。流動相一稀釋液與正丙醇按體積比混 合（71:29 v/v），如需調(diào)整（參見色譜分析 系統(tǒng)適應(yīng)性62）分離度溶液：用稀釋液配制濃度為 2.0mg/ml的重組人生長激素溶液或添加 0.01%終濃度的疊氮化鈉，然后室溫放置24 小時。注：配制后48小時內(nèi)使用，或冷藏 保存供試溶液一用稀釋液配制2.0mg/ml重 組人生長激素溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）注：溶液 維持在2-8，24小時內(nèi)使用，若使用自動 進(jìn)樣器，應(yīng)維持在2-8色譜分析系統(tǒng)（參見色譜分析方法

9、621）配備 220nm 檢測波長，4.6mm X 25cm色譜柱，包括填充L26,溫度控制45C， 流速為0.5ml/min。分析分離度溶液，記錄 峰響應(yīng)。重組人生長激素主峰與鄰近峰之間 分離度R不小于1.0，拖尾因子0.9-1.8。方法：上樣2.0%記錄色譜圖，測量 峰響應(yīng)值，根據(jù)下列公式計算重組人生長激 素雜質(zhì)峰百分比。100AI/（AI+AS）其中AI除重組人生長激素主峰及溶劑 可忽視峰的其它所有峰響應(yīng)值。氣為重組人 生長激素主峰響應(yīng)值，結(jié)果總雜質(zhì)峰不得超 過 6.0%。高分子量蛋白一磷酸緩沖液，流動相，稀釋 液，分離度溶液和色譜系統(tǒng)參照含量測定項 下進(jìn)行。供試溶液參照含量測定供試液準(zhǔn)

10、備。方法一取供試溶液20gl上樣，記錄色 譜圖，測量主峰和主峰之前除溶劑峰以外的 峰面積。根據(jù)下公式計算重組人生長激素中 高分子量蛋白的百分比。100Ah（Ah+Am）其中，Ah為高分子量峰面積總和。Am 為供試液色譜圖單體峰面積：高分子蛋白不 得超過4%?？偟鞍滓唬▍⒁姺止夤舛确?51）磷酸緩沖液一配制0.025M磷酸二氫鉀 溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0。供試溶液精確稱量重組人生長激素 于適量緩沖液中，溶解并稀釋成在最大吸收 波長（280nm）吸光度為0.5-1.0之間的溶液。方法一用1cm分光光度計比色池測定 供試液在最大吸收波長（280nm ）和320nm 波長的吸光度，磷酸緩沖液作空

11、白對照。根 據(jù)下公式計算重組人生長激素總蛋白量 (mg)。V (A-A max320)/0.82其中V為供試溶液體積，Amax和A320分 別為供試溶液在最大吸收波長和320nm波 長的吸光度。含量測定一磷酸緩沖液一稱量無水磷酸二氫鈉 5.18g，磷酸二氫鈉3.65g，加水950ml，用 磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加水至1000ml。流動相一磷酸緩沖液與異丙醇按比例 混合（97:3 v/v）可適當(dāng)調(diào)整（參見色譜分 析方法系統(tǒng)適應(yīng)性621）。稀釋液一水和磷酸緩沖液1.5:1比例混 合。分離度溶液一取一小瓶USP重組人生 長激素標(biāo)準(zhǔn)品置于50C烘箱中12-24小時。 從烘箱中取出，用稀釋液溶解并稀釋至

12、濃度 約1mg/ml，其中包含二聚體1%-2%。標(biāo)準(zhǔn)品溶液一取適量USP重組人生長 激素標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液配制成濃度為 1.0mg/ml的溶液。供試溶液一精確稱取適量重組人生長 激素溶解于稀釋液中，或用稀釋液稀釋一重 組人生長激素溶液，制成濃度約1mg/ml注: 如需要，可參照總蛋白量檢測實驗確定蛋白 總量。色譜分析系統(tǒng)一（參見色譜分析方法 621）色譜分析配備214nm檢測波長， 7.8nmX30cm色譜柱，填充L33，室溫，流 速0.6ml/min。記錄峰響應(yīng)，分析分離度。 分離度R （取決于峰谷比，二聚體和單體峰 之間峰谷高度與二聚體峰高之比）不得超過 過0.4，單體峰拖尾因子（主峰）不得超

13、過 1.7。方法一分別上樣相同體積（約20 G標(biāo) 準(zhǔn)液和供試液，記錄倆次重組人生長激素單 體峰（主峰）的保留時間，測量單體峰響應(yīng) 值，根據(jù)下公式計算供試品中重組人生長激 素的含量（mg/ml）。CS（ru/rs）其中CS為USP重組人生長激素標(biāo)準(zhǔn)品 溶液濃度；ru和rs分別為供試液和標(biāo)準(zhǔn)液單 體峰響應(yīng)值。USP參照標(biāo)準(zhǔn)11一USP內(nèi)毒素RS; USP重組人生長激素RS 鑒別一參照重組人生長激素鑒別項下要求 進(jìn)行。生物鑒別一參照重組人生長激素生物鑒別 項下要求進(jìn)行。注：如果注射用重組人生 長激素粉末經(jīng)過驗證并符合要求，那么不需 要完成此實驗細(xì)菌內(nèi)毒素85 每mg重組人生長激素不 超過 20 US

14、P EU。無菌85參照無菌產(chǎn)品薄膜過濾檢測要 求。色譜純度檢查一參照重組人生長激素項下 色譜純度檢查方法進(jìn)行，總雜志峰不超過12%。高分子量蛋白一參照重組人生長激素高分 子量檢測方法進(jìn)行，除實驗試劑外，高分子 量蛋白不超過6%。含量測定一磷酸鹽緩沖液，流動相，稀釋液，分離 度溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液，色譜系統(tǒng)參照重組人 生長激素含量測定項下進(jìn)行。供試溶液一用稀釋液配制成濃度為 1mg/ml生長激素溶液于適當(dāng)尺寸容器內(nèi)。方法一參照重組人生長激素項下進(jìn)行， 根據(jù)下公式計算每劑量中重組人生長激素 含量（mg）C （V/N） （ru/rs）公式中C為USP重組人生長激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（mg/ml）； V為供試溶液總體積； N為供試溶液的劑量數(shù)；ru和