DNA的生物合成課件

1、 第十章DNA 的生物合成 中 心 法 則復制 轉錄 翻譯DNA RNA 蛋白質 逆轉錄 RNA 復制 遺傳信息的傳遞途徑第一節(jié) 半保留復制Messelson 與 Stahl 的實驗以15NH4Cl為氮源培養(yǎng)細菌若干代，則親代 DNA 鏈為重鏈。換用14NH4Cl為氮源培養(yǎng)細菌，則新生的子代 DNA 為輕鏈。真核生物細胞可利用氨甲蝶呤抑制從頭合成，同時以 5-溴尿嘧啶標記。利用 CsCl 密度梯度離心，可以鑒定 DNA 分子的密度。 DNA 重鏈與 DNA 輕鏈子一代與子二代 DNA 的密度半保留復制的生物學意義第二節(jié) DNA 復制的酶學DNA復制的基本條件：核苷酸單體：dNTP遺傳信息的指導

2、：模板 DNA酶與蛋白因子：DNA 聚合酶 解螺旋酶引物酶 拓撲異構酶連接酶 單鏈結合蛋白參與 DNA 復制蛋白的分析方法純化：分離在邏輯上與復制有關的蛋白質。重建：在體外利用純化蛋白進行組合，重建 復制過程。突變：利用遺傳突變體作為工具，通過各種 突變型的功能缺失，確定特定基因在 活體的功能。 溫度敏感突變型：許可溫度 33 非許可溫度 41一、復制的化學反應反應：(dNTP)ndNTP (dNTP)n1Ppi特點：需要引物與模板，有方向性。二、 DNA 聚合酶DNA-dependent DNA polymerase，DDDP.1958 年，Kornberg 首先自大腸桿菌純化了 DNA 聚

3、合酶 I。在具有模板、底物與引物的條件下，可以在體外催化 DNA 新鏈的合成。目前在細菌中發(fā)現(xiàn)了 5 類 DNA 聚合酶，在真核細胞中也發(fā)現(xiàn)了 5 類 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶 I需要模板 (ssDNA) 與引物 (DNA/RNA)。具有 3 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。5， 3，外切活性：切除 RNA 引物。DNA 聚合酶 I 的校讀作用DNA pol I 聚合活性遠高于 3， 5，外切活性。發(fā)生錯配時聚合活性降低，外切活性起作用。錯誤參入率約 105，校讀后為 1010。DNA 聚合酶 I 的結構109 kDa 單一多肽鏈，在枯草桿菌蛋白酶

4、作用下可被裂解為大片段與小片段。大片段具有聚合與校讀活性，稱 Klenow 片段。DNA 聚合酶 I 的作用DNA pol I 不是 DNA 復制中起主要作用的酶。延伸速度較慢：20 nt/sec。持續(xù)合成能力約 200 bp。大腸桿菌基因組 DNA 長度為 4106 bp，以 pol I 完成復制需一天時間。大腸桿菌 20 min 分裂一代，完成復制只需 40 min。DNA 聚合酶 I 的作用生理功能：DNA 損傷修復；在復制過程中起輔助作用。突變株(只有正?；钚缘?1)不致死，只是對紫外線敏感。5， 3，外切活性缺陷則致死。每個大腸桿菌約含有幾百個 pol I，含量相對穩(wěn)定，不受細胞生長

5、狀態(tài)的影響。DNA 聚合酶 II具有 2 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。延伸速度慢，只有 5 nt/sec，持續(xù)合成能力約 1500 bp，不適應于復制。突變型大腸桿菌能夠正常生長。功能不明，推測可能與 SOS 修復有關。DNA 聚合酶 III具有 2 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。延伸速度快，可達 1000 nt/sec，適用于復制。聚合酶 III 在細胞內(nèi)數(shù)目較少 (20)，且只在細胞生長期間出現(xiàn)，因此最后發(fā)現(xiàn)。是 DNA 復制主要的酶。溫度敏感突變型是致死突變。DNA 聚合酶 III 的結構核心酶：聚合活

6、性：校讀活性：參與亞基組建：結合模板并滑動。 復合物：引導亞基與 模板的結合。10 種亞基組成的多聚體蛋白，每種亞基 2 個，分子量約 140 kDa。3 種 DNA 聚合酶的比較DNA 聚合酶 IV 和 VDNA pol IV 和 V 是在 1999 年才發(fā)現(xiàn)的，涉及傾向錯誤的復制機制。當 DNA遭受嚴重損傷時可誘導兩種酶的生成，完成損傷處的 DNA 復制。因無完整的模板指導，復制缺乏準確性。真核生物 DNA 聚合酶真核細胞的線粒體 DNA線粒體具有自身的遺傳物質。線粒體基因組與細菌相似，為環(huán)狀雙鏈。人類線粒體 DNA 編碼 37 個基因。13 個基因編碼 ATP 合成相關蛋白，24 個編碼

7、 tRNA。線粒體 DNA 隨線粒體的分裂而復制，代謝方式于細菌類似。有觀點認為：真核細胞是古細菌在厭氧細胞中寄生后產(chǎn)生的。三、解鏈相關蛋白：解螺旋酶模板 DNA 必須是單鏈，因此 DNA 復制時必須解鏈。解螺旋酶：helicase，水解 ATP 提供能量解開 DNA 雙螺旋。在大腸桿菌中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少于 10 種解螺旋酶。1976 年第一個解螺旋酶被發(fā)現(xiàn)，稱為 helicase I。它參與了 F 因子的復制(滾環(huán)復制的方式)。參與復制的主要解螺旋酶是 dnaB 基因產(chǎn)物，可以表示為 DnaB。解螺旋酶的種類解螺旋酶有六聚體與二聚體兩類。解螺旋酶結合 DNA 單鏈，有方向性?？煞譃?53 與

8、 35 兩種方向。解螺旋酶 DnaBDnaB ，又稱復制型 DNA 解螺旋酶，6 亞基同聚體。其突變型 DNA復制缺陷。 聚合物成為環(huán)狀，結合于 DNA 單鏈，53 方向滑動解開 DNA 雙鏈。 功能：與 DnaA、DnaC 相互作用，參與復制起始。與 DnaG 協(xié)同，形成引發(fā)體合成引物。與 DNA pol III 結合，參與復制全過程。三、解鏈相關蛋白：單鏈結合蛋白Single strand binding protein，SSB。同源四聚體，可結合單鏈 DNA，并且具有協(xié)同效應。作用：防止單鏈回復其雙螺旋狀態(tài)。保護單鏈不被損傷因素破壞。突變型致死，說明是復制所必需。三、解鏈相關蛋白：拓撲異

9、構酶改變 DNA 雙鏈盤繞的圈數(shù)，解決拓撲學限制。原核生物環(huán)狀 DNA 分子盤繞圈數(shù)無法改變。真核生物線狀 DNA 分子極長，也不能改變。大腸桿菌 DNA 復制時其 DNA 每秒旋轉 100 次。拓撲異構酶：topoisomerase，即能水解又能連接磷酸二酯鍵。拓撲異構酶的種類拓撲異構酶 I：產(chǎn)生瞬間單鏈斷裂，催化負超螺旋的松弛。在細菌稱蛋白，突變型不致死，非復制必需。突變導致負超螺旋增加，影響轉錄活性。拓撲異構酶 II：產(chǎn)生瞬間雙鏈斷裂，在無 ATP 時松弛超螺旋，在有 ATP 時可引入負超螺旋。在細菌稱旋轉酶 (gyrase)，結構形式為A2B2。復制必需。是新生霉素、抗萘啶酮酸等抗生素

10、的作用靶。拓撲異構酶 I 的作用機理拓撲異構酶 II 的作用機理拓撲異構酶 II 的作用機理作用：引入或解開超螺旋。松解連環(huán)。四、引物酶與引發(fā)體DNA 聚合酶需要引物，生理條件下以 RNA 作為引物，而 DNA 不可能成為引物。引物由引物酶 (primase) 合成，dnaG 基因的產(chǎn)物是引物酶。引物酶是 RNA 聚合酶，可從頭開始模板鏈互補鏈的合成。引物酶與 DnaB 及 DnaC 蛋白形成引發(fā)體而發(fā)揮作用。BCG53模板鏈 RNA 引物 (5 nt)Primasome Dna B (helicase) Dna C (bind DnaB) Dna G (primase)OH35引發(fā)體：pri

11、mosomeDNA 連接酶Ligase，連接 DNA 雙鏈的單鏈切口，此反應需要能量。大腸桿菌 DNA 連接酶利用 NAD提供能量。 OH P3 55 35 3連接酶DNA 連接酶作用機理第三節(jié) DNA 復制的過程在真核生物，DNA復制發(fā)生于 S 期。一、復制的起始復制是否具有固定位點？是單一位點還是多位點？同時向兩個方向進行還是單向進行？需要哪些蛋白的參與？過程如何？原核生物的復制起始點同位素標記，放射自顯影，電鏡觀察，可見復制期間的 DNA 呈狀。復制起點是單一的。真核生物的復制起始點真核生物為多復制起點。依據(jù)復制速度推斷： 人類基因組 6109 bp，單一起點需 3 天。事實上完成 S

12、期只需要 68 小時。電鏡觀察可見多復制起點。由一個復制起點引導復制的區(qū)域是一個復制子。哺乳動物的復制子大約在 100200 kb 之間。雙向復制右圖：對細菌進行一段時間的低放射性標記后進行短時間強放射性標記，然后放射自顯影。下圖：果蠅 DNA，短暫強放射性后弱放射性標記。原核生物具有固定復制起始點細菌生長同步化后同位素標記新生 DNA。用已知位點基因序列進行雜交檢測。復制有單一固定起點，雙向復制。復 制 叉兩條 DNA 單鏈的復制是不對稱的。一條鏈連續(xù)合成，為前導鏈 (leading)。另一條鏈不連續(xù)合成，為隨從鏈 (lagging)。岡崎片段隨從鏈上新生的不連續(xù)片段稱岡崎片段。因岡崎首先發(fā)

13、現(xiàn)而得名。大腸桿菌復制起始點的結構跨度 245 bp，包含 3 個正向重復與 2 對反向重復。13 bp 正向重復：GATCTCTTATTAG，富含 AT， 易于解鏈。 9 bp 反向重復：TGTGGATTATTATACACA DnaA 蛋白結合部位。大腸桿菌復制起始過程大腸桿菌復制起始過程 起始復合物 起始后 1 分鐘的狀態(tài)原核生物復制起始的調(diào)控Col E1 質粒的復制時，由 RNA II 作為引物。RNA I 可干擾 RNA II 的作用，Pop 蛋白則可促進 RNA I 與 RNA II 的結合，均能夠抑制質粒復制。Rop 基因突變可以使質粒的拷貝數(shù)大幅度增加。原核生物復制起始的調(diào)控在大

14、腸桿菌復制起點含有 11 個 GATC 回文序列，可被甲基化酶甲基化。半甲基化的新鏈不能復制，相比與其它部位的甲基化(1.5min)，起始點甲基化需 13 min。原核生物復制起始的調(diào)控半甲基化 OriC 可與膜結合，而全甲基化狀態(tài)不能結合。與膜的結合對 DNA 在分裂時的分配非常重要。真核生物復制起始與調(diào)控在酵母細胞，復制起點稱為自主復制序列，autonomously replicating sequences，ARS。ARS 序列長度約 150 bp，其中含有 11 個堿基的保守序列，是 ORC 復合體結合的部位。起點識別復合物，origin recognition complex在一條酵

15、母染色體可能有多個 ARS，酵母的 17 條染色體共有 400 個 ARS。在高等動物細胞中還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的起始序列，起始區(qū)域有較大的隨機性。真核生物復制起始與調(diào)控在 G1 期，Cdc6p 結合于 ORC。Cdc6p 的結合促進 MCM 復合體的形成。當酵母細胞進入 S 期后，兩種蛋白激酶激活轉錄。CDK-cyclin BCdc7p-Dbf4p二、復制的延伸前導鏈與后隨鏈的合成在延伸過程中，前導鏈與后隨鏈的合成平行進行。DNA 聚合酶 III 的不對稱性是其結構基礎。岡崎片段間的連接滾環(huán)復制一些單鏈 DNA噬菌體 或 F 因子的復制方式。在 F 因子復制時，單鏈產(chǎn)物穿過細菌間結合性菌毛進行傳遞

16、。滾環(huán)復制真核生物的延伸過程復制的主要酶是 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶的作用是合成引物。PCNA，增殖細胞核抗原。功能類似于原核聚合酶 III 的亞基。RFC，類似原核聚合酶 III 的復合物。RPA，單鏈結合蛋白。真核生物核小體的復制在真核生物，DNA 復制時核小體結構必需首先解離。在復制完成后，新生的 DNA 鏈迅速與組蛋白結合，重新形成核小體。真核生物核小體的復制同位素標記新生核小體，通過交聯(lián)劑交聯(lián)，分析后發(fā)現(xiàn)，核小體的重新組裝是半保留的。核小體發(fā)生了解離和重新組裝。三、復制的終止原核生物具有復制終止點復制終止于起始點的對側，但不是自發(fā)終止。具有兩個復制終止區(qū)，分別作用于兩個復制叉。

17、終止區(qū)包含 23 bp 的保守序列，只能單向起作用。Tus 蛋白結合并終止復制。線狀 DNA 復制的末端問題線狀 DNA 復制時末端將產(chǎn)生小范圍缺失。這段缺失區(qū)域稱為 primer gap。如果不能修復，則 DNA 將隨復制的代數(shù)而逐步縮短。端 粒 telomere真核細胞染色體末端的特殊結構，由 DNA 及端粒結合蛋白組成。作用：保證染色體結構的穩(wěn)定。解決末端問題。結構：短序列重復多次而成。 人類：TTAGGG，515 kb。端 粒 酶 telomerase細胞中存在端粒酶，可延長端粒。端粒酶作用于 DNA 的 3，末端，延長端粒的重復單位。其互補鏈區(qū)域可完成一次新的后隨鏈合成。端粒酶的作用

18、機理端粒酶由酶蛋白及 RNA 組成。端粒延長的爬行模型：利用自身 RNA 模板指導合成 DNA。酶蛋白具有逆轉錄酶活性。端粒是細胞壽命的決定因素 體外培養(yǎng)細胞具有固定的傳代次數(shù)，超過一定代數(shù)細胞將停止分裂并死亡。端粒的長度是細胞壽命的限制因素。端粒的長度隨細胞的分裂而縮短。老齡鼠來源的細胞端粒較幼齡鼠來源的細胞端粒短，分裂代數(shù)也少。分化的體細胞端粒較短，胚胎細胞與干細胞端粒較長。端粒酶是細胞分裂能力的基礎 沒有端粒酶活性的細胞不能無限分裂。具有端粒酶的細胞有無限分裂的潛能。胚胎期細胞以及干細胞等端粒酶活性較強。腫瘤細胞端粒酶活性增強。有可能是腫瘤細胞獲得無限增殖能力的原因之一。第四節(jié) DNA

19、損傷與修復DNA損傷損傷因素正確修復突變細胞死亡一、DNA 損傷內(nèi)在或外在因素造成的 DNA 結構的破壞。內(nèi)在因素：自發(fā)損傷，如 C 脫氨為 U。 正常代謝物造成的損傷，如 O2。外在因素：物理因素：紫外線 化學因素：烷化劑 亞硝酸 堿基類似物 羥胺類物質紫外線造成的損傷紫外線導致嘧啶二聚體的形成。有 T-T；T-C；C-C 三種形式。其他類型的電磁波或粒子束也可造成損傷。亞硝酸鹽造成的損傷亞硝酸造成 A 或 C 脫氨。AH，H 與 C 配對。CU，U 與 A 配對。C 常發(fā)生自發(fā)脫氨，發(fā)生率 8/hr/cell。DNA 含有 T 而無 U 具有重要意義。烷化劑造成的損傷1942 年，英國人最

20、早發(fā)現(xiàn)軍用毒氣氮芥可造成嚴重的 DNA 損傷。烷化劑可造成堿基的烷基化，導致堿基脫離或誘發(fā)突變。二、DNA 損傷修復修復的前提：信息的完整：DNA 雙鏈只損傷一條鏈。需要能量：ATP 或 光能。修復的方式：原位的恢復。損傷部位的切除與再合成。對損傷的耐受。1. 光修復細菌紫外線照射避光死亡細菌紫外線照射可見光照射存活率上升光修復酶：黃素蛋白，可吸收 370 nm 可見光，直接分解嘧啶二聚體。光修復是自然界最古老的一種 DNA 修復方式。在細菌中普遍存在。在植物中也發(fā)揮重要作用在高等動物中作用有限，哺乳動物不具備光修復酶。2. 切除修復切除損傷部位并合成新生 DNA 鏈以替代之。DNA 雙鏈中只

21、有一條受損時可修復。切除修復是自然界分布最廣，也是最重要的一種修復方式。方式：ABC 內(nèi)切酶參與的核苷酸切除修復。糖苷酶與 Ap 內(nèi)切酶參與的堿基切除修復。細菌的核苷酸切除修復ABC 內(nèi)切酶在損傷處兩側產(chǎn)生切口，去除 1213 nt 片段。DNA pol I 與 ligase 完成填補。人類的切除修復缺陷：著色性干皮病Xeroderma pigmentosum, XP患者皮膚對紫外線敏感，易患皮膚癌。共發(fā)現(xiàn)了 9 種基因與此病有關。機制：解螺旋酶解鏈 兩種內(nèi)切酶酶切 pol /填補堿基切除修復尿嘧啶糖苷酶，嘧啶二聚體糖苷酶等可切除堿基，產(chǎn)生無嘌呤無嘧啶位點 (Ap 位點)。Ap 內(nèi)切酶在 Ap

22、 位點 5，端產(chǎn)生切口。DNA pol I 完成切除與填補。3. 重組修復損傷部位復制時無法生成互補鏈，產(chǎn)生大范圍缺失。recA 基因編碼重組蛋白。recA細菌對紫外線敏感。本身并不能修復損傷，只是一種對損傷的耐受機制，保證遺傳信息的完整。損傷可在下一輪復制前被修復。損傷可被無限稀釋。4. SOS 修復在細菌 DNA 損傷嚴重時激發(fā)的一種傾向差錯的修復機制。雙鏈同時受損，遺傳信息丟失。細菌中存在特異性較差的復制系統(tǒng)，正常情況下其基因不活躍，被 Lex A 蛋白所抑制。RecA 蛋白具有蛋白酶活性，可被 DNA 損傷激活。RecA 酶解 Lex A，從而激活 SOS 修復。LexA 蛋白的作用傾向差錯的復制體系LexA 的分解導致多種基因的活化：激活切除修復機制，如 uvrB 基因。激活特異性低的復制體系。DNA pol IV 與 V：DNA Pol III 在復制時受阻，可被 IV 或 V 所替換。RecA可直接酶解并激活 DNA pol V：UmuD2UmuC UmuD，2UmuC三、突 變DNA 堿基序列的異常改變。突變發(fā)生的原因：復制中的錯誤參入。DNA 損傷的異常修復或未能修復。突變的種類：錯配缺失與插入重排DNA 鏈上堿