第四部分 生物化學與分子生物學技術實踐

1、第四部分 生物化學與分子生物學技術實踐高頻考點突破考點一 血紅蛋白的提取和分離1.蛋白質分離的依據 蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、 所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對 其他分子的親和力等，可以用來提取和分離不同 種類的蛋白質。2.方法及原理 （1）凝膠色譜法原理 蛋白質比較相對分子質量大相對分子質量小凝膠內部不能進入能進入運動方式垂直向下垂直向下和無規(guī)則擴散運動經過路程較短較長洗脫次序先流出后流出提醒 凝膠色譜柱的直徑大小不影響分離效果，但直徑過大造成洗脫液體積大，樣品稀釋度大；凝膠色譜柱的高度與分離度有關。（2）凝膠電泳法原理凝膠電泳法的原理是不同蛋白質的帶電性質、電量、

2、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。如下表：決定運動方向形成庫侖力形成阻力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小3.實驗操作流程 紅細胞洗滌離心去除血清 樣品的處理 釋放血紅蛋白蒸餾水漲破 分離血紅蛋白離心處理 粗分離透析（去除小分子雜質） 純化凝膠色譜法進行分離和純化 純度鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相 對分子量提醒 紅細胞洗滌過程中，洗滌三次后，上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法除去血漿蛋白；離心時轉速要低，時間要短，否則白細胞等會一同沉淀，達不到分離效果。血紅蛋白釋放過程中，蒸餾水的作用是漲破紅細胞，

3、甲苯的作用主要是溶解細胞膜。為了加快干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，逐漸升溫至接近沸騰，通常只需12 h。這種方法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內的空氣。滴加樣品時，吸管管口要貼著管壁環(huán)繞移動，防止破壞凝膠面。對位訓練1.為了提取血紅蛋白，從學校附近的屠宰場索取新 鮮的豬血，對豬血處理的正確操作是 （ ） A.要在采血容器中預先加入抗凝血劑檸檬酸鈉 B.取血回來后，馬上進行高速長時間離心 C.將離心后的血細胞加入清水緩慢攪拌 D.重復洗滌直到上清液呈紅色為止A2.洗滌紅細胞時，離心所用方法為 （ ） A.低速長時間離心 B.低速短時間離心 C.高速

4、長時間離心 D.高速短時間離心B考點二 植物芳香油的提取1.植物芳香油的基本知識 （1）成分：組成較復雜，主要包括萜類化合物 及其衍生物。 （2）特點：具有很強的揮發(fā)性，易溶于有機 溶劑。 （3）應用：玫瑰精油是制作高級香水的主要成 分，能使人產生愉悅感；橘皮精油的主要成分是 檸檬烯，具誘人的橘香味，是食品、化妝品和香 水配料的優(yōu)質原料。2.玫瑰精油的提取流程 鮮玫瑰花+清水水蒸氣蒸餾油水混合物 分離油層 除水 玫瑰油3.玫瑰精油提取操作的關鍵 （1）安裝裝置順序：從左到右，自下而上。 （2）溫度計位置：溫度計水銀球的上限與蒸餾瓶 側管的下限處在同一水平線上。 （3）冷凝管中的水流向：從下方進

5、水，上方出 水，與蒸氣流向相反。加入NaCl加入無水Na2SO4過濾 （4）加熱時防暴沸：墊石棉網，向液體中加入幾粒沸石或瓷片。 （5）燒瓶內液體量：燒瓶容積的1/32/3。 （6）除水：加入無水Na2SO4后，放置時間可適當延長些。 （7）溫度及時間：為提高產品質量，要嚴格控制蒸餾溫度，可適當延長蒸餾時間。4.橘皮精油的提取流程 石灰水浸泡漂洗壓榨過濾靜置再次過 濾橘皮油5.橘皮精油提取操作的關鍵 （1）橘皮的處理：干燥后一定要用石灰水浸透， 時間至少10 h以上。 （2）壓榨液的處理：可以先用普通布袋過濾除去 固體物和殘渣，然后離心進一步除去質量較小的 殘留固體物，再用分液漏斗或吸管將上層

6、的橘皮 油分離出來。對位訓練3.植物芳香油易溶于 （ ） A.水 B.鹽酸 C.碳酸 D.酒精D4.橘皮在壓榨前，應用下列哪種液體浸泡（ ） A.石灰水 B.水 C.酒精 D.鹽酸A考點三 蒸餾、壓榨和萃取三種方法的比較提取方法水蒸氣蒸餾壓榨法有機溶劑萃取實驗原理利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的芳香油攜帶出來通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)溶劑后就可獲得芳香油方法步驟（1）水蒸氣蒸餾（2）分離油層（3）除水過濾（1）石灰水浸泡、漂洗（2）壓榨、過濾、靜置（3）再次過濾（1）粉碎、干燥（2）萃取、過濾（3）濃縮適用范圍適用于提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性強的芳香油適用于柑橘、

7、檸檬等易焦糊原料的提取適用范圍廣，要求原料的顆粒要盡可能細小，能充分浸泡在有機溶液中優(yōu)點簡單易行，便于分離生產成本低，易保持原料原有的結構和功能出油率高，易分離局限性水中蒸餾會導致原料焦糊和有效成分水解等問題分離較為困難，出油率相對較低使用的有機溶劑處理不當會影響芳香油的質量提醒 水蒸氣蒸餾要適當延長蒸餾時間，溫度不能太高。用于萃取的有機溶劑必須事先精制，除去雜質。壓榨時原料必須要浸透，這樣壓榨時不會滑脫，出油率高，不堵塞篩眼；使用石灰水充分浸泡原料，破壞細胞結構，分解果膠，防止橘皮壓榨時滑脫，提高出油率。對位訓練5.我們選擇提取玫瑰精油的方法是 （ ） A.水氣蒸餾 B.壓榨法 C.水中蒸餾

8、 D.萃取法C6.橘皮精油提取時一般采用 （ ） A.水中蒸餾 B.壓榨法 C.水上蒸餾 D.萃取法B考點四 PCR擴增技術與體內DNA復制1.PCR的反應過程 （1）變性：當溫度上升到90以上時，雙鏈DNA 解旋為單鏈，如下圖： （2）復性：溫度下降到50左右，兩種引物通 過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，如下圖：（3）延伸：溫度上升到72左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如下圖：2.PCR擴增技術和DNA復制的比較DNA復制PCR擴增技術場所細胞核內生物體外原理堿基互補配對堿基互補配對酶DNA聚合酶、解旋酶耐熱的DNA聚合酶（Taq

9、酶）條件模板、ATP、引物鏈（RNA）、常溫模板、ATP、引物鏈（DNA及RNA片段）、溫度變化（909555607075）原料四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸特點形成的是整個DNA分子，一個細胞周期只復制一次短時間內形成大量目的基因DNA片段，呈指數(shù)增長2n對位訓練7.標準的PCR過程一般分為變性、復性、延伸三大 步，這三大步需要的溫度依次是 （ ） A.92、50、72 B.72、50、92 C.50、92、72 D.80、50、72A8.引物的作用是 （ ） A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始復制 D.提供模板C思維方法探究思維誤區(qū)警示易錯分析

10、 蛋白質提取與分離的原理不清楚方法原理凝膠色譜法根據相對分子質量的大小分離蛋白質電泳法根據各種分子帶電性質的差異以及分子本身大小、形狀的不同進行分離糾正訓練 使用凝膠色譜法分離蛋白質實驗中，相對分子質 量不同的蛋白質在凝膠中的行進過程，可表示為 圖中 （ ）B知識綜合應用重點提示 通過“胡蘿卜素的提取與鑒定實驗”的考查，提升“用文字、圖表以及數(shù)學的方式等多種形式準確地描述生物學方面的內容”的能力。典例分析 如圖為提取胡蘿卜素的裝置圖，請 據圖回答下列問題： （1） 的作用是 。 （2） 內加入的萃取液一般是 ， 原料在加入前，一般要進行 、 處理。 （3）該萃取過程采用的是水浴加熱，其目的是

11、。 （4）為了取得最佳萃取效果，萃取的時間應該 。解析 圖示裝置為萃取裝置，其中為冷凝管，其作用在于降溫，以防止加熱時有機溶劑揮發(fā)，是燒瓶，其內裝有萃取劑，胡蘿卜素的適宜萃取劑是石油醚，為防止有機溶劑明火加熱時引起燃燒、爆炸，萃取時有必要采用水浴加熱，而不用明火加熱。答案 （1）冷凝管 降溫，防止加熱時有機溶劑揮發(fā) （2）燒瓶 石油醚 粉碎 干燥 （3）避免使用明火加熱引起燃燒、爆炸 （4）長拓展提升 比較萃取裝置與水中蒸餾裝置（1）兩種裝置中均具冷凝裝置，但放置的方式和作用不同。蒸餾裝置比萃取裝置多了接收瓶及牛角管，且設有溫度計以檢測蒸氣溫度。（2）蒸餾裝置中，燒瓶中裝的蒸餾水可直接加熱，而

12、萃取裝置中裝的是有機溶劑（萃取劑），故不可直接加熱（需水浴加熱）。變式訓練 右圖為胡蘿卜素的紙層析結果示意圖，請據圖回答問題：（1）該圖所示的鑒定方法稱為 。（2）基線一般距底邊 cm。（3）A、B、C、D四點中，屬于標準樣品的樣點是 ，屬于提取樣品的樣點是 。點樣的要求是 。（4）在圖中的層析譜中，代表的物質是 ，代表的物質是 。（5）該層析的目的是 ，而在“綠葉中色素的提取和分離”的實驗中層析的目的是 。解析 該圖為胡蘿卜素的紙層析結果示意圖，所示的鑒定方法為紙層析鑒定法?；€一般在濾紙下端距底邊2 cm處，在基線上取A、B、C、D四點，用最細的注射器針頭分別吸取標準樣品和提取樣品，在A、

13、D和B、C點上點樣，點樣應快速細致，在基線上形成直徑為2 mm左右的圓點，每次點完后可以用吹風機吹干，注意保持濾紙干燥。圖中和分別是標準樣品-胡蘿卜素和分離出的其他色素及雜質。答案 （1）紙層析鑒定法 （2）2 （3）A和D B和C 點樣應該快速細致，圓點細小，每次點樣時濾紙都要干燥 （4）-胡蘿卜素 其他色素和雜質（5）胡蘿卜素粗品的鑒定 提取并分離葉綠體中的色素，探究色素的種類和顏色定時檢測1.2008年5月20日民政部等制訂汶川大地震遇難人 員遺體處理意見指出，無法確認遇難者身份的， 由公安部門提取可供DNA檢驗的檢材以便事后身 份辨認。事后的遺體辨認可借助于DNA雜交技 術，即從遺體細

14、胞與死者家屬提供的死者生前生 活用品中分別提取DNA，然后借助DNA雜交技術對 遺體進行確認。據此回答： （1）為了確保辨認的準確性，需要克隆出較多的 DNA樣品。這需借助PCR技術。使用PCR技術的具體實驗操作順序是：按配方準備好各組分 離心使反應液集中在離心管底部設計好PCR儀的循環(huán)程序進行PCR反應。請寫出圖中方框的步驟： ，該步操作應特別注意的問題是 。A組B組C組遺體中的DNA堿基序列ACTGACGGTTGGCTTATCGAGCAATCGTGC家屬提供的DNA堿基序列TGACTGCCAACCGAATAGCACGGTAAGACG（2）上表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中提取的

15、三條相同染色體上的同一區(qū)段DNA單鏈的堿基序列，根據堿基互補配對情況進行判斷，A、B、C三組DNA中不是同一人的是 。（3）為什么從死者體細胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的DNA可以完全互補配對？ 。解析 PCR技術是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。這項技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地應用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等領域。DNA雜交技術方法是從遺體細胞和死者家屬提供的死者生前的生活用品中分別提取DNA，在一定溫度下，水浴共熱，使DN

16、A氫鍵斷裂，雙鏈打開。若兩份DNA樣本來自同一個體，在溫度降低時，兩份樣本中的DNA單鏈通過氫鍵連接在一起，若不是來自同一個體，則兩份樣本中的DNA單鏈在一定程度上不能互補，DNA雜交技術就是通過這一過程對面目全非的死者進行辨認的。答案 （1）用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分PCR實驗使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌（2）B、C （3）人體所有體細胞均由一個受精卵有絲分裂產生，其細胞核中均含有相同的遺傳物質2.對血紅蛋白（Hb）的研究結果表明，血紅蛋白實際 上是由珠蛋白、原卟琳和二價鐵離子（Fe2+）所組 成的結合蛋白質，由4條肽鏈各結合一個輔基即血

17、紅素，O2結合于Fe2+上，血紅蛋白與氧疏松結合形 成氧合血紅蛋白（HbO2），這種氧合作用在氧分壓 高時容易進行，在氧分壓低時易于解離。紅細胞結 合和攜帶O2的過程并不影響Fe2+，也就是說不會使 之氧化為Fe3+。Fe3+無攜帶O2的能力。CO與Hb的親和 力大于O2，結合成HbCO后不能分離，致使Hb喪失運 輸O2和CO2的機能，這稱為一氧化碳中毒即煤氣 中毒。（1）用凝膠色譜法分離血紅蛋白時，待 接近色譜柱底端時，才用試管收集。血紅蛋白因含 而呈現(xiàn)紅色。（2）要使血紅蛋白從紅細胞中釋放出來，可選用的方法是 。（3）紅細胞具有運輸氧的功能，是因為 。（4）亞硝酸鹽為強氧化劑，進入人體后，

18、可使血紅蛋白失去運輸氧的功能，導致人體組織缺氧，其可能的原因是 。解析 用凝膠色譜法分離血紅蛋白時，血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色，待紅色區(qū)帶接近色譜柱底端時，才用試管收集。將紅細胞置于蒸餾水中，加40%體積的甲苯，攪拌使紅細胞破裂并釋放出血紅蛋白。紅細胞中的血紅蛋白與氧在氧分壓高時容易結合，在氧分壓低時又容易分離。亞硝酸鹽可將血細胞中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而使其失去與氧結合的能力。答案 （1）紅色區(qū)帶 血紅素 （2）將紅細胞置于蒸餾水中，加40%體積的甲苯，攪拌使之破裂并釋放血紅蛋白（3）紅細胞中的血紅蛋白與氧在氧分壓高時容易結合，在氧分壓低時又容易分離 （4）亞硝酸鹽可使血細胞中

19、低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白3.PCR（聚合酶鏈式反應）技術是一項在生物體外 復制特定的DNA片段的核酸合成技術，下圖表示 合成過程，請據圖分析回答： （1）A過程高溫使DNA變性解旋，對該過程的原理 敘述，正確的是 。 A.該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B.該過程用到限制性核酸內切酶破壞磷酸二酯鍵 C.該過程不需要解旋酶的作用 D.該過程與人體細胞的過程完全相同（2）C過程要用到的酶是 。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增時可以 加入， （需要/不需要）再添加。PCR反應除提供酶外，還需要滿足的基本條件有： 。（3）如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記

20、，控制“94-55-72”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占 。 （4）如果模板DNA分子共有a個堿基對，其中含有胞嘧啶m個，則該DNA復制10次，需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸 個。（5）PCR中由堿基錯配引起的變異屬于 。假設對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占 。解析 （1）高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?。?）C過程為PCR技術的延伸階段，當系統(tǒng)溫度上升至72左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。Taq DNA聚合酶是耐熱的，

21、高溫下不變性，所以一次性加入即可。（3）PCR技術遵循半保留復制的特點。經過三次循環(huán)，共產生23個DNA分子，其中有2個DNA分子含有15N標記。（4）在一個雙鏈DNA分子中，C+T占堿基總數(shù)的一半，故T的數(shù)目為a-m，復制10次，相當于新增加了210-1個DNA分子。故需補充T的數(shù)目為（210-1）（a-m）。（5）基因中的堿基對改變屬于基因突變。對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，以后按正常配對方式進行擴增，錯配鏈作模板擴增的都是錯誤的DNA分子，原正常鏈擴增得到的DNA分子都是正常的DNA分子，故若干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占3/4

22、。答案 （1）C （2）Taq DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行 （3）25% （4）（210-1）（a-m） （5）基因突變 75%4.紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是 由血紅蛋白完成的，血紅蛋白的主要功能是攜帶 O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動 物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請 回答下列有關問題： （1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步： 、 、 和 。 （2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器 中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白

23、溶液。 加入檸檬酸鈉的目的是 。 以上所述的過程即是樣品處理，它包括 、 、收集血紅蛋白溶液。（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經過透析，這就是樣品的粗分離。透析的目的是 。透析的原理是 。（4）然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。樣品純化的目的是 。血紅蛋白有什么特點？ 。這一特點對進行蛋白質的分離有什么意義？ 。解析 本題主要考查蛋白質分離與鑒定的基本原理及實驗流程。分離、提取血紅蛋白的實驗流程大致是樣品處理粗分離純化純度鑒定四個步驟。檸檬酸鈉屬于抗凝劑。血紅蛋白是紅色含鐵的蛋白質。凝膠色譜法分離蛋白質是依據蛋白質的相對分子質量大小來進行的

24、。答案 （1）樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定（2）防止血液凝固 紅細胞的洗滌 血紅蛋白的釋放（3）去除相對分子質量較小的雜質 透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內（4）通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去 血紅蛋白呈現(xiàn)紅色 在用凝膠色譜法分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時期應該收集洗脫液；這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作5.血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成 成分，負責血液中O2和部分CO2的運輸。請根據血 紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。 （1）將實驗流程補充完整：A為 ，B為 。 凝膠色譜法的基本原理是根據 而達到 蛋白質分離的有效方法。（2

25、）洗滌紅細胞的目的是去除 ，洗滌次數(shù)過少，無法除去 ；離心速度過高和時間過長會使 一同沉淀，達不到分離的效果。洗滌干凈的標志是 。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是 。（3）在洗脫過程中加入物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）的目的是 。如果紅色區(qū)帶 ，說明色譜柱制作成功。答案 （1）血紅蛋白的釋放 樣品的加入和洗脫相對分子質量的大小 （2）雜蛋白（血漿蛋白）血漿蛋白 白細胞和淋巴細胞 離心后的上清液中沒有黃色 蒸餾水和甲苯 （3）準確模擬生物體內的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內的一致 均勻一致的移動6.請回答下列與實驗室提取芳香油有關的問題： （1）植物芳香油的提取可采用

26、的方法有壓榨法、 和 。 （2）芳香油溶解性的特點是不溶于 ， 易溶于 ，因此可用 作為提取劑來 提取芳香油。 （3）橘子果實含有芳香油，通常可用 作為 材料提取芳香油，而且提取時往往選用新鮮的材 料，理由是 。 （4）對材料壓榨后可得到糊狀液體，為除去其中的 固體物獲得乳狀液可采用的方法是 。（5）得到的乳狀液加入氯化鈉并放置一段時間后，芳香油將分布于液體的 層，原因是 。加入氯化鈉的作用是 。（6）從乳狀液中分離得到的芳香油中要加入無水硫酸鈉，此劑的作用是 。答案 （1）蒸餾法 萃取法 （2）水 有機溶劑有機溶劑（3）橘子皮 芳香油含量較高 （4）過濾（5）上 油層的密度比水層小 增加水層

27、密度，使油和水分層（6）吸收芳香油中殘留的水分7.閱讀以下材料，回答相關問題： 從玫瑰花中提取出的玫瑰精油被稱為“液體黃 金”，是世界香料工業(yè)不可取代的原料，多用于 制造高級香水、化妝品等。提取出的玫瑰精油不 含有任何添加劑或化學原料，是純天然的護膚 品，具有極好的抗衰老和止癢作用，能夠促進細 胞的再生、防止肌膚老化、撫平肌膚細紋，還具 有使人放松、愉悅心情的功效。玫瑰精油的化學 性質穩(wěn)定，難溶于水，易溶于有機溶劑，揮發(fā)性 較強。（1）根據材料中介紹的玫瑰精油的性質，要提取玫瑰精油可以用水中蒸餾和 法提取，但一般采用水中蒸餾的方法，其原因是該法具有 的優(yōu)點。（2）某同學在實驗中設計了如圖所示的裝置提取玫瑰精油，指出該裝置中的兩個錯誤，并予以改正。錯誤1： ；改正： 。錯誤2： ；改正： 。（3）對用上述裝置接收到的乳濁液進行如下處理：玫瑰油與水的混合物 分層 油層 無水玫瑰精油 較純凈的玫瑰精油。試劑A是 ，試劑C是 ，裝置B是 ，試劑C的作用是 。（4）要在短期內獲得大量的優(yōu)良玫瑰苗可采用植物組織培養(yǎng)技術，請回答下列問題：要培養(yǎng)脫毒苗，應選用 部分作為培養(yǎng)材料。利用無性繁殖技術繁殖植物的優(yōu)點是 。試劑A裝置B試劑C過濾解析 （1）應根據原料特點來選擇提取方法