高通量測序入門

1、高通量測序入門第一帖 HYPERLINK /bbs/thread-368220-1-1.html /bbs/thread-368220-1-1.html很高興成為論壇特邀專家，鄙人會接下來的一段時間內(nèi)寫一些高通量測序數(shù)據(jù)方面 的帖子，由淺入深，可能剛開始會比較簡單一些，后面會有一些針對性的專題，也 歡迎各位大俠或小菜提出建議或問題大家一起探討。為了活躍論壇建議大家直接跟 帖或發(fā)新帖，我會盡快回復大家。本人方向也僅限在RNA-seq領域，所以其他領域的問題可能不太了解，只能按照 自己的背景知識和請教別人解答，請大家慢拍磚！另外，由于實驗室課題比較忙，所以可能不能及時發(fā)帖或回復大家，也請見諒。既然

2、是入門專題，那就先簡單說一下，要分析高通量測序數(shù)據(jù)的配置要求吧：聲明：該配置不適用與從華大拿回分析結(jié)果直接寫paper的同學。我認識的一位同 學一點生物信息背景也沒有，直接用華大返回分析結(jié)果發(fā)了很好的文章，如果想這 樣的同學可直接跳過這篇，等待以后的專題。言歸正傳：1.軟配置：生物理論知識：熟悉生命活動的基本過程，對復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)錄后修飾有較 清晰的認識，如果知道cis-element和trans-factor的區(qū)別就更好了。推薦朱玉賢 的分子生物學，能夠掌握60%就差不多了（這是對想通過測序數(shù)據(jù)進行生物分析 同學的要求，如果是做軟件開發(fā)等就無所謂了，比如國內(nèi)做的很好的一些實驗室， 都是

3、數(shù)學或自動化專業(yè)的牛人，以下一些配置也不適用這些牛人）實驗理論知識：不一定要做過實驗，但至少要知道實驗的過程，比如測序前樣本的 處理過程，序列片段化、加接頭、PCR擴增等。也許沒有用，但將來出了問題，你 可以很容易知道問題出在哪里編程知識：要求不用太高，學一些perl就可以了，對于生物專業(yè)的同學（本人就是 生物專業(yè)），強烈推薦perl語言入門，好像現(xiàn)在已經(jīng)出到第五版了。此書極為搞笑， 本人當時看了一個星期，其中幽默的語言導致本人經(jīng)常笑出聲音引得實驗室同學以 為神經(jīng)了。對于有C語言基礎的同學來說簡直就是菜，兩天就可以通了。另外，學 有余力的同學可以學一些 R以及python或java.因為好多軟

4、件都是用R或 python寫的，如果要是比較懶或三國殺很忙抽不出空就算了，學學perl就好了。 切記一點：perl的學習過程中除了基礎知識，一定要看一下哈希和模塊這兩部分。 當然如果你們導師允許你對數(shù)據(jù)去個冗余也要半個月的話，你只學到循環(huán)就可以了。統(tǒng)計學知識：只要大學上過生物統(tǒng)計也就差不多了（遇到二百五的老師你就比較悲 劇了），最基本的知道什么是標準化，正態(tài)分布，p value以及卡方檢驗或Fisher精 確檢驗，多重檢驗,，F(xiàn)DR這些概念和計算方法也就差不多了。推薦從以下統(tǒng)計軟 件中擇一精通之：SAS（比較變態(tài)，碩士期間學了，后來就還給老師了）excel （入手比較容易，好好學學，功能比較全

5、，我學的差）matlab（本人認為最牛的統(tǒng)計軟件，有專門的論壇，有興趣的同學可以google 一下） SPSS（上手比較容易，而且很多漢化的非常好，新手同學比較推薦，但是精通比較難）R （最好能學這個，我覺著學R太必要了）perl （指CPAN中的統(tǒng)計模塊，不過需要一點技術）常見數(shù)據(jù)庫：這個根據(jù)自己所做的方向，需要具體問題具體分析，常見的NCBI以 及EBI和UCSC還是需要了解的。計算機操作要求：推薦linux系統(tǒng)，掌握最基本的命令就可以了，還有一些shell命令，建議買一本linux 入門的書看看；對于習慣windows的同學，強烈建議學linux，開始的時候也許你 覺得好多軟件都有win

6、dows版本的，但是早晚你會發(fā)現(xiàn)有很多軟件沒有，所以必須 要學2.硬件要求：計算機要求：現(xiàn)在電腦快跟白菜一個價了，所以建議個人電腦配置的好一點（如果 有服務器就算了），推薦配置：64位系統(tǒng)（32系統(tǒng)的話，內(nèi)存受限，最多識別3G多）， redhat或ubuntu都可以，推薦ubuntu，它的apt-get功能還是比較神器的，4 個CPU差不多，本人極力推薦裝8G內(nèi)存，如果你不能忍受經(jīng)常內(nèi)存溢出的話。 當然如果有服務器，這些都不是問題。至于顯卡什么的，就算了，如果要是你想魔 獸一下的話，可以跟你老板申請一下。對了硬盤大點，因為測序數(shù)據(jù)一般比較大。網(wǎng)絡要求：這個好像你也管不了，一般實驗室都已經(jīng)固定了

7、帶寬。遇有經(jīng)常在數(shù)據(jù) 庫上下一些基因組或其他注釋信息，所以還是進你所能的爭取一下。本人文字表達能力比較差，就嘮嘮叨叨先說這些，下次我會簡單介紹一些高通量測 序的基本知識和發(fā)展過程。對于已經(jīng)掌握這些入門知識（一般也是生物信息的入門 知識）的同學可以飛過，如果你還有哪些不了解，可以簡單的復習一下了！高通量測序入門第二帖 HYPERLINK /bbs/thread-370713-1-1.html /bbs/thread-370713-1-1.html很高興貼完第一帖得到那么多回復，本來這一帖早就該寫的，因為最近課題比較緊 而且遇到很多問題，所以拖到現(xiàn)在，向大家致歉！ 扯 淡 分 割 線正式開始之前，

8、還是扯點八卦。在第一帖之后，有個朋友給我發(fā)郵件問我華大的評 價。我也覺著華大是一個好有爭議的話題。我仔細想了一下那些質(zhì)疑華大的人無非 有兩種理由：1.華大太能忽悠2.對于他們?nèi)〉玫某煽?，很多人都說如果我有那么 多錢我也能做。我跟華大接觸不是很多，而且我讀博之前也那么覺得，可是我現(xiàn)在 覺得我們應該好好的去閱讀一下華大。首先，現(xiàn)在的科研有幾個不在忽悠（此忽悠 不是貶義，試想，我們做的工作在發(fā) paper時總是要寫的意義重要一些，去讓 reviewer覺得有發(fā)表的必要，這是不是忽悠；你去申請基金的時候，總是要把課題 意義拔高再拔高，這是不是忽悠），大家都是在忽悠，何必五十步笑百步呢。2.給 你那么多

9、錢，你也不一定能有他們那么多成果。華大到底拿了多少錢，我不知道， 但是我知道拿他們那么多錢，沒做出東西的人有的是。我知道某個單位，要測某個 微生物的基因組（為了影響就不說是什么物種了，說了物種就很容易知道哪個單位 了），當時Roche 454剛剛出來，該單位將測序意義定義為打破國外高科技技術壟 斷，人工與高通量測序技術賽跑。人才啊，最后的結(jié)果是什么，在徘徊了兩年，花 費數(shù)十萬（或上百萬后），還是送到了華大，倒是真的沒用454,因為已經(jīng)出了通量 更高的Illumina GA，最后文章發(fā)表在某雜志上，篇幅不到一頁，亮點就是作者奇 多，估算一下，每個作者不到十個單詞。當然這么極品的人還是比較少，我只

10、是想 說給你錢，你真的不知道怎么花。 扯 淡 完 分 割 線 扯淡完，進正題，這一貼，主要簡單介紹一些，測序數(shù)據(jù)分析的基本知識，心急的 同學，不要著急，俗話說心急吃不了臭豆腐。首先，介紹一下測序技術的發(fā)展過程和一些標志事件；說道測序，可能最先想到的是Sanger和Maxam-Gilbert這兩個人，至于這兩個人 干了什么，就不用太清楚了，只要知道沒有這兩個人就不會有測序技術的今天. 就像沒有GCD就沒有XZG 一樣，自從有了這兩個人就迎來了分子生物學的春天， 自從有了這兩個人分子生物學事業(yè)煥然一新.事物的發(fā)展總是從量變到質(zhì)變，在這個量變過程中，我們完成偉大的人類基因組計 劃還有很多的模式生物的

11、基因組，那些鄙視華大的同學這里要記住這個過程中，華 大是有貢獻的。質(zhì)變來臨：忽如一夜春風來，ABI 3730型測序儀漸行漸遠，NGS （Next Generation sequence）在哪里？馬上就有答案。Roche 454、Illumina GA、ABI SOLiD伴著春姑娘的腳步出現(xiàn)了。這三種測序平臺的原理、優(yōu)缺點、發(fā)展歷程估計大家已經(jīng)聽的很多了，如果想復習 一下的同學可以google 一下（俗話說，知之為知之，不知google知）。找不到？ 不能吧，兩個檢索方法：1. google 中輸入：filetype:ppt Next Generation sequence. 2.直接pubme

12、d檢索綜述，找稍微好點的雜志，好好復習一下就好了。由于本人用到的數(shù)據(jù)多是Illumina GA平臺，所以我后面的內(nèi)容可能更傾向于這個 平臺。先說幾個概念：fasta格式：其實我也不知道，為什么叫這個名字，其實也不用知道，你只要這 是一種序列存儲格式就好了，大概分為兩行，第一行以 開頭，表明注釋信息，第 二行及往后均為序列信息。fastq格式：這個同樣是序列存儲格式，共分四行，前兩行與fasta 一致，第三 行一般是一個“+”字符，第四行就是序列質(zhì)量分數(shù)，這個分數(shù)看起來有點奇怪，實際 在對測序錯誤率進行l(wèi)og變換后取整用ASCII碼的表述形式。但是不同的測序儀換 算方法稍有不同，這個換算過程，大

13、家有興趣可以看一下，針對自己用的平臺要仔 細看一下。序列比對：alignment,好像沒有什么好解釋的，最簡單的BLAST、BLAT到后 面的Seqmap/Bowtie/SOAP等都是干這個用的，雖然我在工作中從來沒有用過華 大的SOAP,但是某天無聊我測試了下，其性能絕對算不上差，而且protocol竟有 中文版，所以還值得試試?，F(xiàn)在出了N多的軟件，反正原理就是兩個，要么把基因 組做索引，要么把測序的片段做索引.好像知道這么多久可以進行數(shù)據(jù)分析了，可是我特別想寫第四條，就把Illumina GA測轉(zhuǎn)錄組樣本提取流程說一下吧，測基因組的就更簡單一些。第一步：提取總的RNA，具體怎么做大家都比別人清楚，我說了你也不會聽我的， 不會的話就請你師姐/師兄教教你吧。一般他們都比較熱心，愛國愛家愛師妹嘛